लेजर तातो सुन न्यानो पार्टिकल्सको साथ भिट्रोमा अवलोकन गरिएको उच्च तापमानमा जीवन

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)। यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
थर्मोफाइलहरू सूक्ष्मजीवहरू हुन् जुन उच्च तापक्रममा फस्टाउँछन्। तिनीहरूको अध्ययनले जीवन कसरी चरम परिस्थितिहरूमा अनुकूल हुन्छ भन्ने बारे बहुमूल्य जानकारी प्रदान गर्न सक्छ। यद्यपि, पारंपरिक अप्टिकल माइक्रोस्कोपको साथ उच्च तापमान अवस्थाहरू प्राप्त गर्न गाह्रो छ। स्थानीय प्रतिरोधी विद्युतीय तापमा आधारित धेरै घरेलु समाधानहरू प्रस्ताव गरिएको छ, तर त्यहाँ कुनै साधारण व्यावसायिक समाधान छैन। यस पेपरमा, हामीले प्रयोगकर्ताको वातावरणलाई हल्का राख्दै थर्मोफाइल अध्ययनका लागि उच्च तापक्रम प्रदान गर्न माइक्रोस्कोप फिल्डमा माइक्रोस्केल लेजर हीटिंगको अवधारणा प्रस्तुत गर्छौं। मध्यम लेजर तीव्रतामा माइक्रोस्केल तापलाई बायोकम्प्याटिबल र कुशल प्रकाश अवशोषकको रूपमा सुनको न्यानोपार्टिकल लेपित सब्सट्रेट प्रयोग गरेर प्राप्त गर्न सकिन्छ। माइक्रोस्केल फ्लुइड संवहन, सेल प्रतिधारण, र केन्द्रापसारक थर्मोफोरेटिक गतिको सम्भावित प्रभावहरू छलफल गरिन्छ। विधि दुई प्रजातिहरूमा प्रदर्शन गरिएको छ: (i) Geobacillus stearothermophilus, एक सक्रिय थर्मोफिलिक ब्याक्टेरिया जसले लगभग 65 डिग्री सेल्सियसमा पुन: उत्पादन गर्छ, जुन हामीले माइक्रोस्केल ताप अन्तर्गत अंकुरण, बढ्न र पौडी खेलेको अवलोकन गरेका छौं; (ii) Thiobacillus sp., एक इष्टतम हाइपरथर्मोफिलिक आर्किया। 80 डिग्री सेल्सियस मा। यस कार्यले आधुनिक र किफायती माइक्रोस्कोपी उपकरणहरू प्रयोग गरेर थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवहरूको सरल र सुरक्षित अवलोकनको लागि मार्ग प्रशस्त गर्दछ।
अरबौं वर्षहरूमा, पृथ्वीमा जीवनले वातावरणीय अवस्थाहरूको एक विस्तृत श्रृंखलामा अनुकूलन गर्न विकसित भएको छ जुन कहिलेकाहीँ हाम्रो मानव दृष्टिकोणबाट चरम मानिन्छ। विशेष गरी, थर्मोफाइल भनिने केही थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवहरू (ब्याक्टेरिया, आर्किया, फङ्गस) तापमानको दायरामा ४५°C देखि १२२°C1, 2, 3, 4 सम्म फस्टाउँछन्। थर्मोफाइलहरू विभिन्न इकोसिस्टमहरूमा बस्छन्, जस्तै गहिरो समुद्रको हाइड्रोथर्मल भेन्ट्स, तातो पानी वा ज्वालामुखी क्षेत्रहरू। तिनीहरूको अनुसन्धानले विगत केही दशकहरूमा कम्तिमा दुई कारणहरूको लागि धेरै चासो उत्पन्न गरेको छ। पहिलो, हामी तिनीहरूबाट सिक्न सक्छौं, उदाहरणका लागि, कसरी थर्मोफाइलहरू 5, 6, इन्जाइमहरू 7, 8 र झिल्लीहरू 9 यति उच्च तापक्रममा स्थिर हुन्छन्, वा थर्मोफाइलहरूले विकिरणको चरम स्तरहरू कसरी सामना गर्न सक्छन्। दोस्रो, तिनीहरू धेरै महत्त्वपूर्ण बायोटेक्नोलोजिकल अनुप्रयोगहरूका लागि आधार हुन् 1,11,12 जस्तै ईन्धन उत्पादन13,14,15,16, रासायनिक संश्लेषण (डाइहाइड्रो, अल्कोहल, मिथेन, एमिनो एसिड, आदि)17, बायोमाइनिंग18 र थर्मोस्टेबल बायोकैटालिस्ट्स7,11, १३। विशेष गरी, हालको प्रख्यात पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR) 19 मा थर्मोफिलिक ब्याक्टेरियम थर्मस एक्वाटिकसबाट अलग गरिएको इन्जाइम (Taq पोलिमरेज) समावेश छ, जुन पहिलो थर्मोफाइलहरू मध्ये एक हो।
यद्यपि, थर्मोफाइलहरूको अध्ययन सजिलो काम होइन र कुनै पनि जैविक प्रयोगशालामा सुधार गर्न सकिँदैन। विशेष गरी, जीवित थर्मोफाइलहरू कुनै पनि मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपको साथ भिट्रोमा अवलोकन गर्न सकिँदैन, व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध तताउने चेम्बरहरूसँग पनि, सामान्यतया 40 डिग्री सेल्सियस भन्दा कम तापमानको लागि मूल्याङ्कन गरिन्छ। 1990 देखि, केवल केहि अनुसन्धान समूहहरूले उच्च-तापमान माइक्रोस्कोपी (HTM) प्रणालीहरूको परिचयमा आफूलाई समर्पित गरेका छन्। 1994 मा Glukh et al। ताप / शीतलन कक्ष पेल्टियर सेलको प्रयोगको आधारमा परिकल्पना गरिएको थियो जसले एनारोबिसिटी 20 लाई कायम राख्न बन्द आयताकार केशिकाहरूको तापमान नियन्त्रण गर्दछ। यन्त्रलाई 2 °C/s को दरमा 100 °C सम्म तताउन सकिन्छ, जसले लेखकहरूलाई हाइपरथर्मोफिलिक ब्याक्टेरियम थर्मोटोगा मारिटिमा21 को गतिशीलता अध्ययन गर्न अनुमति दिन्छ। 1999 मा Horn et al। एक धेरै समान यन्त्र विकसित गरिएको छ, अझै पनि कोशिका विभाजन / जडान अध्ययन गर्न व्यावसायिक माइक्रोस्कोपीको लागि उपयुक्त तातो केशिकाहरूको प्रयोगमा आधारित छ। सापेक्षिक निष्क्रियताको लामो अवधि पछि, प्रभावकारी HTMs को खोजी 2012 मा पुन: सुरु भयो, विशेष गरी विर्थ समूह द्वारा आविष्कार गरिएको उपकरण प्रयोग गर्ने कागजको श्रृंखलाको सम्बन्धमा। पन्ध्र वर्ष पहिले, हाइपरथर्मोफाइलहरू सहित ठूलो संख्यामा आर्कियाको गतिशीलता, तातो केशिकाहरू 23,24 प्रयोग गरेर 100 डिग्री सेल्सियस सम्मको तापक्रममा अध्ययन गरिएको थियो। तिनीहरूले छिटो तताउने (सेट तापक्रममा पुग्न 35 मिनेटको सट्टा धेरै मिनेट) र माध्यममा 2 सेन्टिमिटर भन्दा बढीको रेखीय तापक्रम ढाँचा प्राप्त गर्न मूल माइक्रोस्कोपलाई पनि परिमार्जन गरे। यो तापक्रम ढाँचा आकार दिने उपकरण (TGFD) जैविक रूपमा प्रासंगिक दूरी 24, 25 मा तापमान ढाँचा भित्र धेरै थर्मोफाइलहरूको गतिशीलता अध्ययन गर्न प्रयोग गरिएको छ।
तातो बन्द केशिकाहरू प्रत्यक्ष थर्मोफाइलहरू अवलोकन गर्ने एक मात्र तरिका होइन। 2012 मा, Kuwabara et al। तातो-प्रतिरोधी टाँस्ने (सुपर X2; सेमेडाइन, जापान) को साथ सील गरिएको घरको डिस्पोजेबल Pyrex चेम्बरहरू प्रयोग गरियो। नमूनाहरू व्यापारिक रूपमा उपलब्ध पारदर्शी तताउने प्लेट (माइक्रो हीट प्लेट, किटाजाटो कर्पोरेशन, जापान) मा राखिएको थियो जुन 110 डिग्री सेल्सियस सम्म तताउन सक्षम थियो, तर मूल रूपमा बायोइमेजिङको लागि होइन। लेखकहरूले 65 डिग्री सेल्सियसमा एनारोबिक थर्मोफिलिक ब्याक्टेरिया (थर्मोसिफो ग्लोबिफोर्मन्स, दोब्बर हुने समय 24 मिनेट) को कुशल विभाजन अवलोकन गरे। 2020 मा, Pulshen et al। व्यापारिक धातुका भाँडाहरू (AttofluorTM, Thermofisher) को कुशल तताउने दुई घरेलु तताउने तत्वहरू प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो: ढक्कन र स्टेज (PCR मेसिन-प्रेरित कन्फिगरेसन)। यो संघ एक समान तरल तापमान मा परिणाम र ढक्कन को तल मा वाष्पीकरण र संक्षेपण रोक्छ। ओ-रिंगको प्रयोगले वातावरणसँग ग्यास आदानप्रदानबाट जोगाउँछ। यो HTM, सल्फोस्कोप भनिन्छ, सल्फोलोबस एसिडोकाल्डेरियस 75°C27 मा चित्रण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।
यी सबै प्रणालीहरूको एक मान्यता प्राप्त सीमा वायु उद्देश्यहरूको प्रयोगमा प्रतिबन्ध थियो, कुनै पनि तेल विसर्जन यस्तो उच्च तापक्रमको लागि अनुपयुक्त हुनु र> 1-मिमी बाक्लो पारदर्शी नमूनाहरू मार्फत इमेजिङको लागि। यी सबै प्रणालीहरूको एक मान्यता प्राप्त सीमा वायु उद्देश्यहरूको प्रयोगमा प्रतिबन्ध थियो, कुनै पनि तेल विसर्जन यस्तो उच्च तापक्रमको लागि अनुपयुक्त हुनु र> 1-मिमी बाक्लो पारदर्शी नमूनाहरू मार्फत इमेजिङको लागि। Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольмективов в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 यी सबै प्रणालीहरूको एक मान्यता प्राप्त कमजोरी वायु उद्देश्यहरूको प्रयोगको लागि सीमितता थियो, किनकि कुनै पनि तेल विसर्जन यस्तो उच्च तापक्रमको लागि र पारदर्शी नमूनाहरू मार्फत भिजुअलाइजेसनको लागि उपयुक्त थिएन > 1 मिमी बाक्लो।所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜,任何油浸都不适合这样頌厚的透明样品成像। यी सबै प्रणालीहरूको मान्यता प्राप्त सीमा भनेको एयर-इन्ट्रेन्ड मिरर प्रयोग गर्ने सीमितता हो, किनकि कुनै पनि तेल डुब्न यस्तो उच्च तापक्रममा पारदर्शी नमूनाहरू> 1 मिमी बाक्लो इमेजिङको लागि अनुपयुक्त हुन्छ। Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любовективов сло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >१ एमएम। यी सबै प्रणालीहरूको एक मान्यता प्राप्त कमजोरी एयर लेन्सको सीमित प्रयोग हो, कुनै पनि तेल डुब्न यस्तो उच्च तापमान र पारदर्शी नमूनाहरू मार्फत दृश्यको लागि अनुपयुक्त छ > 1 मिमी बाक्लो।हालसालै, यो सीमा चार्ल्स-ओर्जाग एट अल द्वारा हटाइयो। 28, जसले चासोको प्रणालीको वरिपरि ताप प्रदान गर्दैन, बरु कभर गिलास भित्र, ITO (इन्डियम-टिन अक्साइड) बाट बनेको प्रतिरोधकको पातलो पारदर्शी तहले ढाकिएको उपकरणको विकास गरे। ढक्कनलाई पारदर्शी तहबाट विद्युतीय प्रवाह पार गरेर ७५ डिग्री सेल्सियससम्म तताउन सकिन्छ। यद्यपि, लेखकले लेन्सलाई उद्देश्यको लागि तताउनु पर्छ, तर 65 डिग्री सेल्सियस भन्दा बढी होइन, ताकि यसलाई क्षति नहोस्।
यी कार्यहरूले देखाउँदछ कि कुशल उच्च-तापमान अप्टिकल माइक्रोस्कोपीको विकास व्यापक रूपमा अपनाइएको छैन, प्रायः घरेलु उपकरणहरू चाहिन्छ, र प्रायः स्थानिय रिजोल्युसनको लागतमा प्राप्त गरिन्छ, जुन थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवहरू केही भन्दा ठूलो नभएको कारण गम्भीर हानि हो। माइक्रोमिटर। HTM को तीनवटा अन्तर्निहित समस्याहरू समाधान गर्ने कुञ्जी तताउने भोल्युम घटाउनु हो: कमजोर स्थानिय रिजोल्युसन, प्रणाली तातो हुँदा उच्च थर्मल जडता, र चरम तापक्रममा वरपरका तत्वहरू (विसर्जन तेल, वस्तुपरक लेन्स... वा प्रयोगकर्ताको हात) को हानिकारक ताप। )।
यस पेपरमा, हामी थर्मोफाइल अवलोकनको लागि एक HTM परिचय गर्छौं जुन प्रतिरोधी तापमा आधारित छैन। यसको सट्टा, हामीले प्रकाश-अवशोषित सब्सट्रेटको लेजर विकिरणद्वारा माइक्रोस्कोपको दृश्य क्षेत्रको सीमित क्षेत्र भित्र स्थानीयकृत ताप हासिल गर्यौं। तापक्रम वितरण मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (QPM) प्रयोग गरेर कल्पना गरिएको थियो। यस विधिको प्रभावकारिता जियोबासिलस स्टीरोथर्मोफिलस, एक गतिशील थर्मोफिलिक ब्याक्टेरिया जसले लगभग 65 डिग्री सेल्सियसमा पुन: उत्पादन गर्छ र कम दोब्बर हुने समय (लगभग 20 मिनेट), र सल्फोलोबस शिबाटे, एक हाइपरथर्मोफाइल जसले राम्रोसँग बढ्छ (80 डिग्री सेल्सियस) द्वारा प्रदर्शन गर्दछ। चित्रण गर्न। सामान्य प्रतिकृति दर र पौडी खेल्ने तापमान को एक प्रकार्य को रूप मा अवलोकन गरियो। यो लेजर HTM (LA-HTM) कभरस्लिपको मोटाई वा उद्देश्यको प्रकृति (हावा वा तेल विसर्जन) द्वारा सीमित छैन। यसले बजारमा कुनै पनि उच्च रिजोल्युसन लेन्स प्रयोग गर्न अनुमति दिन्छ। यो थर्मल जडता (मिलिसेकेन्ड स्केलमा तत्काल तताउने) को कारणले ढिलो तापबाट पनि पीडित हुँदैन र व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध कम्पोनेन्टहरू मात्र प्रयोग गर्दछ। केवल नयाँ सुरक्षा चिन्ताहरू शक्तिशाली लेजर बीमहरू (सामान्यतया 100 मेगावाट सम्म) यन्त्र भित्र र सम्भवतः आँखा मार्फत, जसलाई सुरक्षात्मक चश्माहरू आवश्यक पर्दछ।
LA-HTM को सिद्धान्त माइक्रोस्कोप (चित्र 1a) को क्षेत्र भित्र स्थानीय रूपमा नमूना तताउन लेजर प्रयोग गर्नु हो। यो गर्न, नमूना प्रकाश अवशोषित हुनुपर्छ। उचित लेजर पावर (100 मेगावाट भन्दा कम) प्रयोग गर्न, हामीले तरल माध्यमद्वारा प्रकाशको अवशोषणमा भर परेका छैनौं, तर कृत्रिम रूपमा सुनको न्यानो कणहरू (चित्र 1c) को साथ सब्सट्रेट कोटिंग गरेर नमूनाको अवशोषण बढायो। बायोमेडिसिन, न्यानोकेमिस्ट्री वा सूर्यको किरण कटाई २९,३०,३१ मा अपेक्षित अनुप्रयोगहरू सहित, थर्मल प्लाज्मोनिक्सको क्षेत्रमा प्रकाशको साथ सुनको न्यानो कणहरू तताउनु मौलिक महत्त्वको कुरा हो। विगत केही वर्षहरूमा, हामीले यस LA-HTM लाई भौतिक विज्ञान, रसायन विज्ञान र जीवविज्ञानमा थर्मल प्लाज्मा अनुप्रयोगहरूसँग सम्बन्धित धेरै अध्ययनहरूमा प्रयोग गरेका छौं। यस विधिको साथ मुख्य कठिनाई अन्तिम तापमान प्रोफाइल प्रदर्शनमा छ, किनकि उन्नत तापमान नमूना भित्र माइक्रोस्केल क्षेत्रमा सीमित छ। हामीले चार-तरंग लम्बाइ ट्रान्सभर्स शियर इन्टरफेरोमिटर, एक सरल, उच्च-रिजोल्युसन, र दुई-आयामी विवर्तन ग्रेटिंग्स (क्रस ग्रेटिङ्हरू पनि भनिन्छ) को प्रयोगमा आधारित मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपीको धेरै संवेदनशील विधिको साथ तापमान म्यापिङ हासिल गर्न सकिन्छ भनेर देखाएका छौं। ३३,३४,३५,३६। क्रस ग्रेटिंग वेभफ्रन्ट माइक्रोस्कोपी (CGM) मा आधारित यस थर्मल माइक्रोस्कोपी प्रविधिको विश्वसनीयता गत दशक ३७,३८,३९,४०,४१,४२,४३ मा प्रकाशित एक दर्जन पत्रहरूमा प्रदर्शन गरिएको छ।
समानान्तर लेजर ताप, आकार र तापमान माइक्रोस्कोप स्थापना को योजना। b नमूना ज्यामिति जसमा एटोफ्लोरटीएम चेम्बर हुन्छ जसमा सुनको न्यानो पार्टिकल्सले कभरस्लिप लेपित हुन्छ। ग नमूनालाई नजिकबाट हेर्नुहोस् (मापन गर्न होइन)। d ले एकसमान लेजर बीम प्रोफाइल र (e) सुनको न्यानो कणहरूको नमूना प्लेनमा अनुकरण गरिएको पछिल्लो तापमान वितरणलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। f एक कुण्डाकार लेजर बीम प्रोफाइल हो जुन (g) मा देखाइएको नतिजाको तापक्रम वितरणको सिमुलेशनमा देखाइए अनुसार समान तापमान उत्पन्न गर्न उपयुक्त छ। स्केल बार: 30 माइक्रोन।
विशेष गरी, हामीले हालै LA-HTM र CGM को साथ स्तनधारी कोशिकाहरूको तताउने हासिल गर्यौं र 37-42 ° C को दायरामा सेलुलर तातो झटका प्रतिक्रियाहरू ट्र्याक गर्‍यौं, एकल जीवित कोष इमेजिङमा यो प्रविधिको उपयोगिता प्रदर्शन गर्दै। यद्यपि, उच्च तापक्रममा सूक्ष्मजीवहरूको अध्ययनमा LA-HTM को प्रयोग अस्पष्ट छैन, किनकि यसले स्तनधारी कोशिकाहरूको तुलनामा बढी सावधानी अपनाउनुपर्छ: सबैभन्दा पहिले, मध्यमको तल्लो भागलाई दसौं डिग्री (केही डिग्री भन्दा पनि) तताउने हो। बलियो ठाडो तापमान ढाँचामा। तरल संवहन 44 सिर्जना गर्न सक्छ, यदि सब्सट्रेटमा दृढतापूर्वक जोडिएको छैन भने, अवांछनीय आन्दोलन र ब्याक्टेरियाको मिश्रण हुन सक्छ। यस संवहनलाई तरल तहको मोटाई घटाएर हटाउन सकिन्छ। यस उद्देश्यको लागि, तल प्रस्तुत गरिएका सबै प्रयोगहरूमा, ब्याक्टेरियल निलम्बनहरू धातुको कप (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c) भित्र राखिएको लगभग 15 µm बाक्लो कभरस्लिपहरू बीचमा राखिएको थियो। सिद्धान्तमा, तरलको मोटाई तताउने लेजरको बीम आकार भन्दा सानो भएमा संवहनबाट बच्न सकिन्छ। दोस्रो, यस्तो सीमित ज्यामितिमा काम गर्दा एरोबिक जीवहरू निसास्सिन सक्छन् (चित्र S2 हेर्नुहोस्)। यो समस्या अक्सिजन (वा कुनै अन्य महत्त्वपूर्ण ग्यास) को लागी पारगम्य सब्सट्रेट प्रयोग गरेर, कभरस्लिप भित्र फसेको हावा बुलबुले छोडेर, वा माथिल्लो कभरस्लिपमा प्वालहरू ड्रिल गरेर (चित्र S1 हेर्नुहोस्) 45 लाई बेवास्ता गर्न सकिन्छ। यस अध्ययनमा, हामीले पछिल्लो समाधान (चित्र 1b र S1) रोज्यौं। अन्तमा, लेजर तापले समान तापमान वितरण प्रदान गर्दैन। लेजर बीम (चित्र 1d) को समान तीव्रतामा पनि, तापक्रम वितरण समान छैन, बरु थर्मल प्रसार (चित्र 1e) को कारण गाउसियन वितरणसँग मिल्दोजुल्दो छ। जब लक्ष्य जैविक प्रणालीहरूको अध्ययनको लागि दृश्यको क्षेत्रमा सटीक तापक्रम स्थापना गर्ने हो, असमान प्रोफाइलहरू आदर्श हुँदैनन् र यदि तिनीहरूले सब्सट्रेटलाई पालना गर्दैनन् भने ब्याक्टेरियाको थर्मोफोरेटिक आन्दोलनलाई पनि नेतृत्व गर्न सक्छ (चित्र S3, S4 हेर्नुहोस्) 39। यस उद्देश्यका लागि, हामीले नमूनाको समतलमा रिंग (चित्र 1f) को आकार अनुसार इन्फ्रारेड लेजर बीमलाई आकार दिनको लागि स्पेसियल लाइट मोड्युलेटर (SLM) प्रयोग गर्यौं जुन दिइएको ज्यामितीय क्षेत्र भित्र पूर्ण रूपमा समान तापक्रम वितरण प्राप्त गर्न, थर्मल डिफ्युजन (चित्र 1d) 39, 42, 46। मध्यम वाष्पीकरणबाट बच्नको लागि धातुको भाँडा (चित्र 1b) मा माथिल्लो कभरस्लिप राख्नुहोस् र कम्तिमा केही दिनको लागि अवलोकन गर्नुहोस्। किनभने यो शीर्ष कभरस्लिप सील गरिएको छैन, अतिरिक्त माध्यम आवश्यक भएमा कुनै पनि समयमा सजिलै थप्न सकिन्छ।
LA-HTM ले कसरी काम गर्छ र थर्मोफिलिक अनुसन्धानमा यसको उपयोगिता देखाउनको लागि, हामीले एरोबिक ब्याक्टेरिया जियोबासिलस स्टीरोथर्मोफिलसको अध्ययन गर्‍यौं, जसको इष्टतम वृद्धि तापमान लगभग 60-65 डिग्री सेल्सियस हुन्छ। ब्याक्टेरियममा फ्ल्यागेला र पौडी खेल्ने क्षमता पनि हुन्छ, जसले सामान्य सेलुलर गतिविधिको अर्को सूचक प्रदान गर्दछ।
नमूनाहरू (चित्र 1b) एक घण्टाको लागि 60 डिग्री सेल्सियसमा पूर्व-इन्क्युबेटेड थिए र त्यसपछि LA-HTM नमूना होल्डरमा राखिएको थियो। यो पूर्व इन्क्युबेशन ऐच्छिक छ, तर अझै पनि उपयोगी छ, दुई कारणहरूका लागि: पहिलो, लेजर सक्रिय हुँदा, यसले कोषहरू तुरुन्तै बढ्छ र विभाजित हुन्छ (पूरक सामग्रीमा चलचित्र M1 हेर्नुहोस्)। प्रि-इन्क्युबेशन बिना, ब्याक्टेरियाको बृद्धि सामान्यतया लगभग 40 मिनेट ढिलो हुन्छ जब प्रत्येक पटक नमूनामा नयाँ दृश्य क्षेत्र तातो हुन्छ। दोस्रो, 1 घण्टा पूर्व-इन्क्युबेशनले ब्याक्टेरियालाई कभरस्लिपमा टाँसिएकोलाई बढावा दियो, लेजर खोल्दा थर्मोफोरेसिसको कारण कोशिकाहरूलाई दृश्य क्षेत्रबाट बाहिर निस्कनबाट रोक्छ (पूरक सामग्रीमा फिल्म M2 हेर्नुहोस्)। थर्मोफोरेसिस भनेको तापमान ढाँचाको साथ कण वा अणुहरूको आन्दोलन हो, सामान्यतया तातोदेखि चिसोसम्म, र ब्याक्टेरिया कुनै अपवाद हुँदैनन्। यो अवांछनीय प्रभाव लेजर बीम को आकार र एक समतल तापमान वितरण प्राप्त गर्न को लागी SLM को प्रयोग गरेर दिइएको क्षेत्र मा हटाइन्छ।
अंजीर मा। चित्र 2 ले एक कुण्डलीय लेजर बीम (चित्र 1f) संग सुनको न्यानो कणहरू लेपित गिलास सब्सट्रेट विकिरण गरेर प्राप्त CGM द्वारा मापन गरिएको तापमान वितरण देखाउँदछ। लेजर बीमले ढाकिएको सम्पूर्ण क्षेत्रमा समतल तापक्रम वितरण देखियो। यो क्षेत्र 65 डिग्री सेल्सियस मा सेट गरिएको थियो, इष्टतम वृद्धि तापमान। यस क्षेत्र बाहिर, तापमान वक्र स्वाभाविक रूपमा \(1/r\) मा खस्छ (जहाँ \(r\) रेडियल समन्वय हो)।
गोलाकार क्षेत्रमा समतल तापक्रम प्रोफाइल प्राप्त गर्न सुनको न्यानो कणहरूको तहलाई विकिरण गर्नको लागि कुण्डाकार लेजर बीम प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको CGM मापनको तापमान नक्सा। b तापक्रम नक्शाको आइसोथर्म (a) लेजर बीम को समोच्च एक खैरो डटेड सर्कल द्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको छ। प्रयोग दुई पटक दोहोर्याइएको थियो (पूरक सामग्री, चित्र S4 हेर्नुहोस्)।
LA-HTM प्रयोग गरेर ब्याक्टेरियल कोशिकाहरूको व्यवहार्यता धेरै घण्टासम्म निगरानी गरिएको थियो। अंजीर मा। 3 ले 3 घण्टा 20 मिनेटको चलचित्रबाट लिइएका चार तस्बिरहरूको लागि समय अन्तराल देखाउँदछ (चित्र M3, पूरक जानकारी)। ब्याक्टेरिया लेजर द्वारा परिभाषित गोलाकार क्षेत्र भित्र सक्रिय रूपमा फैलिएको देखियो जहाँ तापमान इष्टतम थियो, 65 डिग्री सेल्सियस पुग्यो। यसको विपरित, 10 सेकेन्डको लागि तापमान 50 डिग्री सेल्सियस भन्दा कम हुँदा कोशिकाको वृद्धि उल्लेखनीय रूपमा कम भयो।
G. स्टीरोथर्मोफिलस ब्याक्टेरियाको अप्टिकल गहिराई छविहरू विभिन्न समयमा लेजर ताप पछि बढ्दै, (a) t = 0 मिनेट, (b) 1 h 10 मिनेट, (c) 2 h 20 मिनेट, (d) 3 h 20 मिनेट, बाहिर 200 एक मिनेटको फिल्मबाट निकालिएको (पूरक जानकारीमा प्रदान गरिएको M3 फिल्म) सम्बन्धित तापक्रम नक्सामा सुपरइम्पोज गरिएको। लेजर समयमा सक्रिय हुन्छ \(t=0\)। तीव्रता छविमा आइसोथर्महरू थपिएका छन्।
कोशिकाको बृद्धि र तापमानमा यसको निर्भरतालाई थप मापन गर्न, हामीले चलचित्र M3 फिल्ड अफ दृश्य (चित्र 4) मा प्रारम्भिक रूपमा पृथक ब्याक्टेरियाका विभिन्न उपनिवेशहरूको बायोमासको वृद्धि नाप्यौं। मिनी कोलोनी गठन इकाई (mCFU) गठनको सुरुमा चयन गरिएका अभिभावक ब्याक्टेरियाहरू चित्र S6 मा देखाइएको छ। ड्राई मास मापन CGM 48 क्यामेराको साथ लिइयो जुन तापमान वितरण नक्सा गर्न प्रयोग गरिएको थियो। सुक्खा तौल र तापमान मापन गर्न CGM को क्षमता LA-HTM को बल हो। अपेक्षित रूपमा, उच्च तापक्रमले ब्याक्टेरियाको तीव्र वृद्धि निम्त्याउँछ (चित्र 4a)। चित्र 4b मा सेमी-लग प्लटमा देखाइए अनुसार, सबै तापक्रममा वृद्धिले घातीय वृद्धिलाई पछ्याउँछ, जहाँ डेटाले घातीय प्रकार्य प्रयोग गर्दछ \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}, जहाँ \(\tau {{{{\rm{log }}}}}}2\) – जेनेरेशन समय (वा दोब्बर हुने समय), \( g =1/ \ tau\) - वृद्धि दर (प्रति एकाइ समय विभाजन संख्या)। अंजीर मा। 4c ले तापमानको प्रकार्यको रूपमा सम्बन्धित वृद्धि दर र उत्पादन समय देखाउँछ। द्रुत बृद्धि हुने mCFUs दुई घण्टा पछि वृद्धिको संतृप्ति द्वारा विशेषता हो, उच्च ब्याक्टेरियल घनत्व (शास्त्रीय तरल संस्कृतिहरूमा स्थिर चरण जस्तै) को कारण अपेक्षित व्यवहार। सामान्य आकार \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) 60-65°C वरिपरि इष्टतम वृद्धि दरको साथ G. स्टीरोथर्मोफिलसको लागि अपेक्षित दुई-चरण वक्रसँग मेल खान्छ। कार्डिनल मोडेल (चित्र S5) 49 प्रयोग गरी डेटा मिलाउनुहोस् जहाँ \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}}} ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, जुन साहित्यमा उद्धृत अन्य मानहरूसँग राम्रोसँग सहमत छ। तापक्रममा निर्भर प्यारामिटरहरू पुन: उत्पादन गर्न सकिने भए तापनि \({G}_{0}\) को अधिकतम वृद्धि दर एक प्रयोगबाट अर्कोमा फरक हुन सक्छ (चित्रहरू S7-S9 र चलचित्र M4 हेर्नुहोस्)। तापक्रम फिटिंग प्यारामिटरहरूको विपरीत, जुन विश्वव्यापी हुनुपर्छ, अधिकतम वृद्धि दर अवलोकन गरिएको माइक्रोस्केल ज्यामिति भित्र माध्यम (पोषक तत्वहरूको उपलब्धता, अक्सिजन एकाग्रता) को गुणहरूमा निर्भर गर्दछ।
विभिन्न तापमानमा माइक्रोबियल वृद्धि। mCFU: लघु कालोनी गठन एकाइहरू। तापक्रम ढाँचा (चलचित्र M3) मा बढिरहेको एकल ब्याक्टेरियाको भिडियोबाट प्राप्त डाटा। b समान (a), अर्ध-लोगारिदमिक स्केल। c वृद्धि दर\(\tau\) र उत्पादन समय\(g\) रैखिक प्रतिगमन (b) बाट गणना। तेर्सो त्रुटि बारहरू: तापमान दायरा जसमा mCFUs वृद्धिको समयमा दृश्यको क्षेत्रमा विस्तार भयो। ठाडो त्रुटि बारहरू: रैखिक प्रतिगमन मानक त्रुटि।
सामान्य वृद्धिको अतिरिक्त, केहि ब्याक्टेरिया कहिलेकाहीं लेजर तताउने समयमा दृश्यमा तैरिन्छन्, जुन फ्ल्यागेला भएका ब्याक्टेरियाहरूको लागि अपेक्षित व्यवहार हो। अतिरिक्त जानकारी मा चलचित्र M5 यस्तो पौडी गतिविधिहरु देखाउँछ। यस प्रयोगमा, एक समान लेजर विकिरणलाई तापमान ढाँचा सिर्जना गर्न प्रयोग गरिएको थियो, जस्तै चित्र 1d, e र S3 मा देखाइएको छ। चित्र 5 ले M5 चलचित्रबाट चयन गरिएका दुई छवि अनुक्रमहरू देखाउँदछ कि एउटा ब्याक्टेरियाले दिशात्मक आन्दोलन प्रदर्शन गर्दछ जबकि अन्य सबै ब्याक्टेरियाहरू गतिहीन रहन्छन्।
दुई समय फ्रेमहरू (a) र (b) ले डटेड सर्कलहरू चिन्ह लगाइएका दुई फरक ब्याक्टेरियाहरूको पौडी खेल्ने देखाउँछन्। छविहरू M5 चलचित्रबाट निकालिएका थिए (पूरक सामग्रीको रूपमा प्रदान गरिएको)।
G. stearothermophilus को मामला मा, ब्याक्टेरिया को सक्रिय आन्दोलन (चित्र 5) लेजर बीम खोलिएको केहि सेकेन्ड पछि सुरु भयो। यस अवलोकनले यस थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवको तापमानमा वृद्धिको लागि अस्थायी प्रतिक्रियालाई जोड दिन्छ, जस्तै मोरा एट अल द्वारा अवलोकन गरिएको छ। २४. ब्याक्टेरियल गतिशीलता र थर्मोटेक्सिसको विषयलाई LA-HTM प्रयोग गरेर थप अन्वेषण गर्न सकिन्छ।
माइक्रोबियल स्विमिङलाई अन्य प्रकारको भौतिक गतिसँग भ्रमित गर्नु हुँदैन, अर्थात् (i) ब्राउनियन गति, जुन कुनै निश्चित दिशा बिना अराजक गति जस्तो देखिन्छ, (ii) संवहन 50 र थर्मोफोरेसिस 43, तापक्रमको साथ गतिको नियमित बहावमा समावेश हुन्छ। ग्रेडियन्ट।
G. स्टीरोथर्मोफिलस प्रतिरक्षाको रूपमा प्रतिकूल वातावरणीय अवस्थाहरूमा पर्दा अत्यधिक प्रतिरोधी बीजाणु (बीजाणु गठन) उत्पादन गर्ने क्षमताको लागि परिचित छ। जब वातावरणीय अवस्था फेरि अनुकूल हुन्छ, बीजाणुहरू अंकुरित हुन्छन्, जीवित कोशिकाहरू बनाउँछन् र विकास पुन: सुरु गर्छन्। यद्यपि यो स्पोरुलेशन/अङ्कुरण प्रक्रिया राम्रोसँग थाहा छ, यो वास्तविक समयमा कहिल्यै अवलोकन गरिएको छैन। LA-HTM प्रयोग गरेर, हामी यहाँ G. stearothermophilus मा अंकुरण घटनाहरूको पहिलो अवलोकन रिपोर्ट गर्छौं।
अंजीर मा। 6a ले 13 स्पोरहरूको CGM सेट प्रयोग गरेर प्राप्त अप्टिकल डेप्थ (OT) को टाइम-लेप्स छविहरू देखाउँछ। सम्पूर्ण सङ्कलन समयको लागि (१५ घन्टा ६ मिनेट, \(t=०\) - लेजर तापको सुरुवात), १३ मध्ये ४ बीजाणु अंकुरित, क्रमिक समय बिन्दुहरूमा \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' र \(11\) h \(30\)'। यद्यपि यी घटनाहरू मध्ये एउटा मात्र चित्र 6 मा देखाइएको छ, 4 अंकुरण घटनाहरू M6 चलचित्रमा पूरक सामग्रीमा अवलोकन गर्न सकिन्छ। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, अंकुरण अनियमित देखिन्छ: वातावरणीय परिस्थितिहरूमा समान परिवर्तन भए तापनि सबै बीजाणुहरू अंकुरित हुँदैनन् र एकै समयमा अंकुर्दैनन्।
8 OT छविहरू (तेल विसर्जन, 60x, 1.25 NA उद्देश्य) र (b) G. स्टीरोथर्मोफिलस एग्रीगेट्सको बायोमास इभोलुसन समावेश गरिएको समय-चक्र। c (b) वृद्धि दर (ड्यास गरिएको रेखा) को रेखीयता हाइलाइट गर्न अर्ध-लग स्केलमा कोरिएको।
अंजीर मा। 6b,c ले डेटा संग्रहको सम्पूर्ण अवधिमा समयको कार्यको रूपमा दृश्यको क्षेत्रमा सेल जनसंख्याको बायोमास देखाउँछ। अंजीरमा \(t=5\)h मा देखाइएको सुख्खा मासको द्रुत क्षय। 6b, c, दृश्यको क्षेत्रबाट केही कक्षहरू बाहिर निस्किएको कारण। यी चार घटनाहरूको वृद्धि दर \(0.77\pm 0.1\) h-1 हो। यो मान चित्र 3. 3 र 4 सँग सम्बन्धित वृद्धि दर भन्दा उच्च छ, जहाँ कोशिकाहरू सामान्य रूपमा बढ्छन्। बीजाणुहरूबाट G. स्टीरोथर्मोफिलसको वृद्धि दरको कारण स्पष्ट छैन, तर यी मापनहरूले LA-HTM को रुचिलाई हाइलाइट गर्दछ र सेल जीवनको गतिशीलताको बारेमा थप जान्न एकल सेल स्तर (वा एकल mCFU स्तरमा) काम गर्दछ। ।
LA-HTM को बहुमुखी प्रतिभा र उच्च तापक्रममा यसको प्रदर्शनलाई थप प्रदर्शन गर्न, हामीले सल्फोलोबस शिबाटे, हाइपरथर्मोफिलिक एसिडोफिलिक पुरातात्विक 80°C51 को अधिकतम वृद्धि तापमानको साथ विकासको जाँच गर्‍यौं। G. स्टीरोथर्मोफिलसको तुलनामा, यी पुरातात्विक क्षेत्रहरूमा पनि धेरै फरक आकारविज्ञान छ, जुन लम्बिएको छडी (बेसिली) भन्दा 1 माइक्रोन गोलाकार (cocci) जस्तो देखिन्छ।
चित्र 7a मा CGM प्रयोग गरेर प्राप्त S. shibatae mCFU को अनुक्रमिक अप्टिकल गहिराई छविहरू समावेश छन् (पूरक सामग्रीहरूमा M7 फीचर फिल्म हेर्नुहोस्)। यो mCFU लगभग 73°C मा बढ्छ, इष्टतम तापमान 80°C भन्दा कम, तर सक्रिय वृद्धिको लागि तापमान दायरा भित्र। हामीले धेरै विखंडन घटनाहरू अवलोकन गर्‍यौं जसले mCFU हरू केही घण्टा पछि आर्कियाको माइक्रोग्रापजस्तो देखिन्थ्यो। यी OT छविहरूबाट, mCFU बायोमास समयको साथ मापन गरिएको थियो र चित्र 7b मा प्रस्तुत गरिएको थियो। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, S. shibatae mCFUs ले G. stearothermophilus mCFUs सँग देखिएको घातीय वृद्धिको सट्टा रेखीय वृद्धि देखाएको छ। कोशिका वृद्धि दरको प्रकृतिको बारेमा लामो समयदेखि छलफल भएको छ: जबकि केही अध्ययनहरूले सूक्ष्मजीवहरूको वृद्धि दर रिपोर्ट गर्दछ जुन तिनीहरूको आकार (घातीय वृद्धि) को समानुपातिक हुन्छ, अरूले स्थिर दर (रैखिक वा द्विरेखीय वृद्धि) देखाउँछन्। Tzur et al.53 द्वारा व्याख्या गरिए अनुसार, घातीय र (bi) रेखीय वृद्धि बीचको भिन्नतालाई बायोमास मापनमा <6% को परिशुद्धता चाहिन्छ, जुन धेरैजसो QPM प्रविधिहरूको पहुँच बाहिर छ, इन्टरफेरोमेट्री पनि समावेश छ। Tzur et al.53 द्वारा व्याख्या गरिए अनुसार, घातीय र (bi) रेखीय वृद्धि बीचको भिन्नतालाई बायोमास मापनमा <6% को परिशुद्धता चाहिन्छ, जुन धेरैजसो QPM प्रविधिहरूको पहुँच बाहिर छ, इन्टरफेरोमेट्री पनि समावेश छ। Как объяснили Цур и др.५३, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях бисмерениях бисмерениях бисмерениях, др QPM को मेटोडोव, даже с использованием интерферометрии। Zur et al.53 द्वारा व्याख्या गरिए अनुसार, घातीय र (द्वि) रेखीय वृद्धि बीचको भिन्नतालाई बायोमास मापनमा <6% शुद्धता चाहिन्छ, जुन प्रायः QPM विधिहरूका लागि अप्राप्य छ, इन्टरफेरोमेट्री प्रयोग गरेर पनि।Zur et al द्वारा व्याख्या गरिए अनुसार। 53, घातीय र (द्वि) रैखिक वृद्धि बीचको भिन्नतालाई बायोमास मापनमा 6% भन्दा कम सटीकता चाहिन्छ, जुन धेरै QPM विधिहरूका लागि अप्राप्य हुन्छ, इन्टरफेरोमेट्री प्रयोग गर्दा पनि। CGM ले बायोमास मापन 36,48 मा sub-pg सटीकता संग यो सटीकता प्राप्त गर्दछ।
6 OT छविहरू (तेल इमर्सन, 60x, NA उद्देश्य 1.25) र (b) CGM सँग मापन गरिएको माइक्रो-CFU बायोमास इभोलुसन समावेश गरिएको समय-लेप्स। थप जानकारीको लागि चलचित्र M7 हेर्नुहोस्।
S. shibatae को पूर्ण रैखिक वृद्धि अप्रत्याशित थियो र अझै रिपोर्ट गरिएको छैन। यद्यपि, घातीय वृद्धि अपेक्षित छ, कम्तिमा किनभने समयको साथमा, 2, 4, 8, 16 ... कोशिकाहरू हुनै पर्छ। हामीले परिकल्पना गर्यौं कि रैखिक वृद्धि घने सेल प्याकिङको कारणले सेल अवरोधको कारण हुन सक्छ, जसरी सेलको वृद्धि सुस्त हुन्छ र अन्ततः सेल घनत्व धेरै उच्च हुँदा निष्क्रिय अवस्थामा पुग्छ।
हामी पालैपालो चासोका निम्न पाँच बुँदाहरू छलफल गरेर निष्कर्षमा पुग्छौं: तापको मात्रामा कमी, थर्मल जडत्वमा कमी, सुनको न्यानो कणहरूमा रुचि, मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपीमा रुचि, र LA-HTM प्रयोग गर्न सकिने सम्भावित तापमान दायरा।
प्रतिरोधात्मक तापको तुलनामा, एचटीएम विकासको लागि प्रयोग गरिएको लेजर हीटिंगले धेरै फाइदाहरू प्रदान गर्दछ, जुन हामीले यस अध्ययनमा चित्रण गर्छौं। विशेष गरी, माइक्रोस्कोपको दृश्यको क्षेत्रमा तरल मिडियामा, तापको मात्रा केही (10 μm) 3 भोल्युम भित्र राखिएको छ। यस तरिकाले, केवल अवलोकन गरिएका सूक्ष्मजीवहरू सक्रिय छन्, जबकि अन्य ब्याक्टेरियाहरू निष्क्रिय छन् र नमूनाको थप अध्ययन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ - प्रत्येक पटक नयाँ तापक्रम जाँच गर्न आवश्यक पर्दा नमूना परिवर्तन गर्न आवश्यक छैन। थप रूपमा, माइक्रोस्केल हीटिंगले तापमानको ठूलो दायराको प्रत्यक्ष जाँच गर्न अनुमति दिन्छ: चित्र 4c 3-घण्टा चलचित्र (Movie M3) बाट प्राप्त गरिएको थियो, जसलाई सामान्यतया धेरै नमूनाहरूको तयारी र परीक्षण आवश्यक पर्दछ - अध्ययन अन्तर्गत प्रत्येक नमूनाहरूको लागि एक। y प्रयोगमा दिनहरूको संख्या प्रतिनिधित्व गर्ने तापक्रम हो। तातो भोल्युम घटाउनुले माइक्रोस्कोपको वरपरका सबै अप्टिकल कम्पोनेन्टहरू, विशेष गरी वस्तुनिष्ठ लेन्सलाई कोठाको तापक्रममा राख्छ, जुन अहिलेसम्म समुदायले सामना गरेको ठूलो समस्या भएको छ। LA-HTM कुनै पनि लेन्सको साथ प्रयोग गर्न सकिन्छ, तेल इमर्सन लेन्स सहित, र दृश्यको क्षेत्रमा चरम तापक्रममा पनि कोठाको तापक्रममा रहन्छ। लेजर तताउने विधिको मुख्य सीमा जुन हामीले यस अध्ययनमा रिपोर्ट गर्छौं त्यो कोशिकाहरू पालना नगर्ने वा फ्लोट नगर्ने दृश्य क्षेत्रबाट टाढा र अध्ययन गर्न गाह्रो हुन सक्छ। केही सय माइक्रोनभन्दा बढी तापक्रम वृद्धि हासिल गर्न कम म्याग्निफिकेसन लेन्सहरू प्रयोग गर्नु एउटा समाधान हुन सक्छ। यो सावधानी स्थानिक रिजोलुसनमा कमीको साथमा छ, तर यदि लक्ष्य सूक्ष्मजीवहरूको आन्दोलनको अध्ययन गर्ने हो भने, उच्च स्थानिय रिजोलुसन आवश्यक पर्दैन।
प्रणाली तताउने (र चिसो) को समय मापन \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}}}}} {{{\mbox{D}}}}\) यसको आकारमा निर्भर गर्दछ, कानून अनुसार \({{{({\rm{\tau }}}}}}__{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), जहाँ \ (L\ ) ताप स्रोतको विशेषता आकार हो (हाम्रो अध्ययनमा लेजर बीमको व्यास \(L\ लगभग १००\) μm हो), \(D\) वातावरणको थर्मल डिफ्युजिविटी हो (औसत हाम्रो केस, गिलास र पानी फैलावट दर\(D\ लगभग 2\fold {10}^{-7}\) m2/s) त्यसैले, यस अध्ययनमा, 50 ms को समय प्रतिक्रियाहरू, अर्थात्, अर्ध-तात्कालिक। तापक्रम परिवर्तन, तापक्रम वृद्धिको यो तात्कालिक स्थापनाले प्रयोगको अवधिलाई मात्र छोटो बनाउँदैन, तापक्रम प्रभावहरूको कुनै पनि गतिशील अध्ययनको लागि सटीक समयलाई अनुमति दिन्छ।
हाम्रो प्रस्तावित विधि कुनै पनि प्रकाश-अवशोषित सब्सट्रेटमा लागू हुन्छ (उदाहरणका लागि, ITO कोटिंग भएको व्यावसायिक नमूनाहरू)। जे होस्, सुनको न्यानो कणहरूले दृश्य दायरामा अवरक्त र कम अवशोषणमा उच्च अवशोषण प्रदान गर्न सक्षम छन्, जसको पछिल्लो विशेषताहरू दृश्य दायरामा प्रभावकारी अप्टिकल अवलोकनको लागि चासोको विषय हो, विशेष गरी प्रतिदीप्ति प्रयोग गर्दा। थप रूपमा, सुन जैवकम्प्याटिबल छ, रासायनिक रूपमा निष्क्रिय छ, अप्टिकल घनत्व 530 एनएम बाट नजिकको इन्फ्रारेडमा समायोजन गर्न सकिन्छ, र नमूना तयारी सरल र किफायती छ29।
ट्रान्सभर्स ग्रेटिंग वेभफ्रन्ट माइक्रोस्कोपी (CGM) ले माइक्रोस्केलमा तापक्रम म्यापिङ मात्र होइन, बायोमास अनुगमनलाई पनि अनुमति दिन्छ, यसलाई LA-HTM सँग संयोजनमा विशेष रूपमा उपयोगी बनाउँछ (यदि आवश्यक छैन भने)। विगत एक दशकमा, अन्य तापक्रम माइक्रोस्कोपी प्रविधिहरू विकास गरिएका छन्, विशेष गरी बायोइमेजिङको क्षेत्रमा, र तीमध्ये धेरैजसोलाई तापमान-संवेदनशील फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू ५४,५५ को प्रयोग आवश्यक छ। यद्यपि, यी विधिहरूको आलोचना गरिएको छ र केही रिपोर्टहरूले कक्षहरू भित्र अवास्तविक तापमान परिवर्तनहरू मापन गरेका छन्, सम्भवतः यस तथ्यको कारणले कि फ्लोरोसेन्स तापमान बाहेक अन्य धेरै कारकहरूमा निर्भर गर्दछ। थप रूपमा, धेरै फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू उच्च तापमानमा अस्थिर हुन्छन्। तसर्थ, QPM र विशेष गरी CGM ले अप्टिकल माइक्रोस्कोपी प्रयोग गरेर उच्च तापक्रममा जीवन अध्ययन गर्नको लागि एक आदर्श तापमान माइक्रोस्कोपी प्रविधिलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
S. shibatae को अध्ययन, जो 80°C मा इष्टतम रूपमा बस्छ, ले देखाउँछ कि LA-HTM हाइपरथर्मोफाइल अध्ययन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ, साधारण थर्मोफाइल मात्र होइन। सैद्धान्तिक रूपमा, LA-HTM प्रयोग गरेर पुग्न सकिने तापमानको दायराको कुनै सीमा छैन, र 100 डिग्री सेल्सियसभन्दा माथिको तापक्रम पनि उमालेको बिना वायुमण्डलीय चापमा पुग्न सकिन्छ, जस्तै हाम्रो 38 को समूहले वायुमण्डलीयमा हाइड्रोथर्मल केमिस्ट्री अनुप्रयोगहरूमा देखाएको छ। दबाब A. सुनको न्यानो पार्टिकल ४० लाई तताउनको लागि लेजर प्रयोग गरिन्छ। तसर्थ, LA-HTM मा मानक अवस्थाहरूमा (अर्थात् वातावरणीय तनाव अन्तर्गत) मानक उच्च रिजोल्युसन अप्टिकल माइक्रोस्कोपीको साथ अभूतपूर्व हाइपरथर्मोफाइलहरू अवलोकन गर्न प्रयोग गर्ने क्षमता छ।
सबै प्रयोगहरू घरेलु माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएका थिए, जसमा Köhler इल्युमिनेशन (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW सँग), म्यानुअल xy आन्दोलन, उद्देश्यहरू (Olympus, 60x, 0.7 NA, air, LUCPlanFLN60X, O125x, 150mW) सहितको नमूना होल्डर। , UPLFLN60XOI), CGM क्यामेरा (QLSI क्रस ग्रेटिंग, 39 µm पिच, Andor Zyla क्यामेरा सेन्सरबाट 0.87 mm) तीव्रता र वेभफ्रन्ट इमेजिङ प्रदान गर्न, र sCMOS क्यामेरा (ORCA फ्ल्यास 4.0 V3, 16-बिट मोड, हमामात्सुबाट रेकर्ड गर्न)। चित्र 5 मा देखाइएको डाटा (ब्याक्टेरिया पौडी खेल्ने)। dichroic बीम स्प्लिटर एक 749 nm BrightLine किनारा हो (Semrock, FF749-SDi01)। क्यामेराको अगाडिको फिल्टर 694 छोटो पास फिल्टर (FF02-694/SP-25, Semrock) हो। टाइटेनियम नीलमणि लेजर (लेजर Verdi G10, 532 nm, 10 W, पम्प गरिएको सुनामी लेजर गुहा, चित्र 2-5 मा स्पेक्ट्रा-फिजिक्स, थप Millenia लेजर द्वारा प्रतिस्थापित, स्पेक्ट्राफिजिक्स 10 W, पम्प गरिएको मीरा लेजर गुहा, F.2 कोहेरेन्ट, -५)। 6 र 7) तरंगदैर्ध्य \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm मा सेट गरिएको छ, जुन सुनको न्यानो कणहरूको प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रमसँग मेल खान्छ। स्थानिय प्रकाश मोड्युलेटरहरू (1920 × 1152 पिक्सेल) Meadowlark Optics बाट खरिद गरिएको थियो।
क्रस ग्रेटिंग वेभफ्रन्ट माइक्रोस्कोपी (CGM) एक पारंपरिक क्यामेराको सेन्सरबाट एक मिलिमिटरको दूरीमा दुई-आयामी विवर्तन ग्रेटिङ् (क्रस ग्रेटिंग पनि भनिन्छ) संयोजनमा आधारित एक अप्टिकल माइक्रोस्कोपी प्रविधि हो। हामीले यस अध्ययनमा प्रयोग गरेका CGM को सबैभन्दा सामान्य उदाहरणलाई चार-वेभलेन्थ ट्रान्सभर्स शिफ्ट इन्टरफेरोमिटर (QLSI) भनिन्छ, जहाँ क्रस-ग्रेटिङ्मा प्रिमोट एट अल द्वारा परिचय र पेटेन्ट गरिएको तीव्रता/फेज चेकबोर्ड ढाँचा समावेश हुन्छ। 200034 मा। ठाडो र तेर्सो ग्रेटिंग रेखाहरूले सेन्सरमा ग्रिड-जस्तो छायाहरू सिर्जना गर्दछ, जसको विकृतिलाई घटना प्रकाशको अप्टिकल वेभफ्रन्ट विरूपण (वा समकक्ष चरण प्रोफाइल) प्राप्त गर्न वास्तविक समयमा संख्यात्मक रूपमा प्रशोधन गर्न सकिन्छ। माइक्रोस्कोपमा प्रयोग गर्दा, CGM क्यामेराले न्यानोमिटर ३६ को अर्डरमा संवेदनशीलताको साथ, अप्टिकल डेप्थ (ओटी) पनि भनिन्छ, इमेज गरिएको वस्तुको अप्टिकल पथ भिन्नता देखाउन सक्छ। कुनै पनि CGM मापनमा, अप्टिकल कम्पोनेन्ट वा बीमहरूमा कुनै पनि दोषहरू हटाउनको लागि, प्राथमिक सन्दर्भ OT छवि लिनु पर्छ र कुनै पनि पछिल्ला छविहरूबाट घटाउनुपर्छ।
सन्दर्भमा वर्णन गरिए अनुसार तापमान माइक्रोस्कोपी CGM क्यामेरा प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो। 32. छोटकरीमा, तरललाई तताउँदा यसको अपवर्तक अनुक्रमणिका परिवर्तन हुन्छ, थर्मल लेन्स प्रभाव सिर्जना गर्दछ जसले घटना बीमलाई विकृत गर्दछ। यो वेभफ्रन्ट विरूपण CGM द्वारा मापन गरिन्छ र तरल माध्यममा त्रि-आयामी तापक्रम वितरण प्राप्त गर्न डिकन्भोल्युसन एल्गोरिदम प्रयोग गरी प्रशोधन गरिन्छ। यदि सुनको न्यानो कणहरू नमूना भरमा समान रूपमा वितरण गरिन्छ भने, तापमान म्यापिङ ब्याक्टेरिया-रहित क्षेत्रहरूमा राम्रो छविहरू उत्पादन गर्न सकिन्छ, जुन हामी कहिलेकाहीं गर्छौं। सन्दर्भ CGM छवि तताउने बिना प्राप्त गरिएको थियो (लेजर बन्द भएकोमा) र पछि लेजर अन भएको छविमा उही स्थानमा क्याप्चर गरियो।
ड्राई मास मापन तापमान इमेजिङको लागि प्रयोग गरिएको उही CGM क्यामेरा प्रयोग गरेर प्राप्त गरिन्छ। CGM सन्दर्भ छविहरू एक्सपोजरको समयमा x र y मा नमूनालाई द्रुत गतिमा सार्दै ब्याक्टेरियाको उपस्थितिको कारण OT मा कुनै पनि असंगतता औसत गर्ने माध्यमको रूपमा प्राप्त गरियो। ब्याक्टेरियाको ओटी छविहरूबाट, तिनीहरूको बायोमास म्याटलाबको घरेलु विभाजन एल्गोरिथ्म (उपखण्ड "संख्यात्मक कोड" हेर्नुहोस्), रेफरीमा वर्णन गरिएको प्रक्रिया पछ्याएर चयन गरिएका क्षेत्रहरूमा छविहरूको समूह प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो। 48. छोटकरीमा, हामी सम्बन्ध प्रयोग गर्छौं \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}y\), जहाँ \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) अप्टिकल डेप्थ छवि हो, \(m\) हो सुख्खा तौल र \({{{{\rm{\alpha }}}}}\) एक स्थिर छ। हामीले \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg छनोट गर्‍यौं, जुन जीवित कोशिकाहरूको लागि एक विशिष्ट स्थिरता हो।
सुनको न्यानो पार्टिकल्सले 25 मिमी व्यास र 150 µm बाक्लो लेप भएको कभर स्लिपलाई एटोफ्लोरटीएम चेम्बर (थर्मोफिशर) मा राखिएको थियो जसमा सुनको न्यानो पार्टिकलहरू माथि राखिएको थियो। Geobacillus stearothermophilus लाई प्रयोगको प्रत्येक दिन अघि LB मध्यम (200 rpm, 60°C) मा रातभर प्रिकल्चर गरिएको थियो। ०.३ देखि ०.५ सम्मको अप्टिकल घनत्व (OD) भएको G. stearothermophilus को सस्पेन्सनको 5 μl को एक थोपा सुनको न्यानो पार्टिकल्सको साथ कभर स्लिपमा राखिएको थियो। त्यसपछि, मध्यमा 5 मिमी व्यासको प्वाल भएको 18 मिमी व्यासको राउन्ड कभर स्लिप ड्रपमा छोडियो, र 5 μl ब्याक्टेरियल निलम्बन उही अप्टिकल घनत्वको साथ बारम्बार प्वालको केन्द्रमा लगाइयो। कभरस्लिपहरूमा कुवाहरू रेफमा वर्णन गरिएको प्रक्रिया अनुसार तयार गरिएको थियो। 45 (थप जानकारीको लागि पूरक जानकारी हेर्नुहोस्)। त्यसपछि तरल तह सुक्नबाट जोगाउन कभरस्लिपमा 1 एमएल एलबी माध्यम थप्नुहोस्। इन्क्युबेशनको समयमा माध्यमको वाष्पीकरण रोक्नको लागि अन्तिम कभरस्लिप Attofluor™ च्याम्बरको बन्द ढक्कनमा राखिन्छ। अंकुरण प्रयोगहरूको लागि, हामीले स्पोरहरू प्रयोग गर्यौं, जुन परम्परागत प्रयोगहरू पछि, कहिलेकाहीँ शीर्ष कभरस्लिपलाई ढाक्छ। सल्फोलोबस शिबटाई प्राप्त गर्न समान विधि प्रयोग गरिएको थियो। तीन दिन (200 rpm, 75°C) थायोबासिलस सेराटाको प्रारम्भिक खेती मध्यम 182 (DSMZ) मा गरिएको थियो।
माइकलर ब्लक कोपोलिमर लिथोग्राफीद्वारा सुनको न्यानो कणहरूको नमूनाहरू तयार पारिएको थियो। यस प्रक्रियालाई अध्यायमा विस्तृत रूपमा वर्णन गरिएको छ। 60. छोटकरीमा, टोल्युनिमा HAuCl4 सँग copolymer मिसाएर सुनको आयनहरू इनक्याप्सुल गर्ने माइकलहरू संश्लेषित गरियो। सफा गरिएको कभरस्लिपहरू त्यसपछि घोलमा डुबाइयो र सुनको बीउ प्राप्त गर्न घटाउने एजेन्टको उपस्थितिमा यूवी विकिरणको साथ उपचार गरियो। अन्तमा, सुनको बीउहरू KAuCl4 र इथेनोलामाइनको जलीय समाधानको साथ 16 मिनेटको लागि कभरस्लिपलाई सम्पर्क गरेर उब्जाइएको थियो, जसको परिणामस्वरूप नजिकको इन्फ्रारेडमा गैर-गोलाकार सुनको न्यानो कणहरूको अर्ध-आवधिक र धेरै समान व्यवस्था भयो।
इन्टरफेरोग्रामहरूलाई OT छविहरूमा रूपान्तरण गर्न, हामीले लिंकमा विस्तृत रूपमा घरेलु एल्गोरिदम प्रयोग गर्यौं। 33 र निम्न सार्वजनिक भण्डारमा Matlab प्याकेजको रूपमा उपलब्ध छ: https://github.com/baffou/CGMprocess। प्याकेजले रेकर्ड गरिएको इन्टरफेरोग्राम (सन्दर्भ छविहरू सहित) र क्यामेरा एरे दूरीहरूमा आधारित तीव्रता र ओटी छविहरू गणना गर्न सक्छ।
दिइएको तापक्रम प्रोफाइल प्राप्त गर्न SLM मा लागू गरिएको चरण ढाँचा गणना गर्न, हामीले पहिले विकसित घरेलु एल्गोरिदम 39,42 प्रयोग गर्यौं जुन निम्न सार्वजनिक भण्डारमा उपलब्ध छ: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping। इनपुट वांछित तापमान क्षेत्र हो, जुन डिजिटल रूपमा वा मोनोक्रोम bmp छवि मार्फत सेट गर्न सकिन्छ।
कक्षहरू विभाजन गर्न र तिनीहरूको सुख्खा वजन मापन गर्न, हामीले निम्न सार्वजनिक भण्डारमा प्रकाशित हाम्रो Matlab एल्गोरिदम प्रयोग गर्यौं: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation। प्रत्येक छविमा, प्रयोगकर्ताले रुचिको ब्याक्टेरिया वा mCFU मा क्लिक गर्नुपर्छ, छडी संवेदनशीलता समायोजन गर्नुहोस्, र चयन पुष्टि गर्नुहोस्।
अध्ययन डिजाइनको बारेमा थप जानकारीको लागि, यस लेखमा लिङ्क गरिएको प्रकृति अनुसन्धान रिपोर्ट सार हेर्नुहोस्।
यस अध्ययनको नतिजालाई समर्थन गर्ने डाटा उचित अनुरोधमा सम्बन्धित लेखकहरूबाट उपलब्ध छन्।
यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको स्रोत कोड विधिहरू खण्डमा विस्तृत छ, र डिबग संस्करणहरू निम्न भण्डारहरूमा https://github.com/baffou/ बाट डाउनलोड गर्न सकिन्छ: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, र CGM_magicWandSegmentation।
मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंह, एच., दामले, डी. र शर्मा, एके इनसाइट इन थर्मोफाइल्स र तिनीहरूको व्यापक स्पेक्ट्रम अनुप्रयोगहरू। मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंह, एच., दामले, डी. र शर्मा, एके इनसाइट इन थर्मोफाइल्स र तिनीहरूको व्यापक स्पेक्ट्रम अनुप्रयोगहरू।मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंह, एच., दामले, डी. र शर्मा, एके थर्मोफाइल्सको अवलोकन र तिनीहरूको व्यापक प्रयोग। मेहता, आर., सिंघल, पी., सिंह, एच., दामले, डी. र शर्मा, एके 深入了解嗜热菌及其广谱应用। मेहता, आर, सिंघल, पी, सिंह, एच, दामले, डी र शर्मा, एके।मेहता आर., सिंघल पी., सिंह एच., दामले डी. र शर्मा एके थर्मोफाइल्सको गहिरो बुझाइ र अनुप्रयोगहरूको विस्तृत दायरा।3 बायोटेक्नोलोजी 6, 81 (2016)।