व्यापक प्रोटियोमिक्सले मस्तिष्कमा आधारित सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्करहरू एसिम्प्टोमेटिक र लक्षणविहीन अल्जाइमर रोगमा प्रकट गर्दछ।

अल्जाइमर रोग (एडी) मा प्रोटिन बायोमार्करहरूको अभाव हुन्छ जसले यसको बहु अन्तर्निहित प्याथोफिजियोलोजीलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, निदान र उपचारको प्रगतिमा बाधा पुर्‍याउँछ। यहाँ, हामी सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) बायोमार्करहरू पहिचान गर्न व्यापक प्रोटोमिक्स प्रयोग गर्छौं जसले AD pathophysiology को एक विस्तृत दायरा प्रतिनिधित्व गर्दछ। मल्टिप्लेक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्रीले AD CSF र मस्तिष्कमा क्रमशः 3,500 र लगभग 12,000 प्रोटीनहरू पहिचान गर्यो। मस्तिष्क प्रोटोमको नेटवर्क विश्लेषणले 44 जैव विविधता मोड्युलहरू समाधान गर्यो, जसमध्ये 15 सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड प्रोटोमसँग ओभरल्याप गरियो। यी ओभरल्यापिङ मोड्युलहरूमा CSF AD मार्करहरू विभिन्न pathophysiological प्रक्रियाहरू प्रतिनिधित्व गर्दै, पाँच प्रोटीन समूहहरूमा तह हुन्छन्। AD मस्तिष्कमा synapses र metabolites घट्छ, तर CSF बढ्छ, जबकि glial-rich myelination र मस्तिष्क र CSF मा प्रतिरक्षा समूह बढ्छ। प्यानल परिवर्तनहरूको स्थिरता र रोग विशिष्टता 500 भन्दा बढी अतिरिक्त CSF नमूनाहरूमा पुष्टि भयो। यी समूहहरूले एसिम्प्टोमेटिक एडीमा जैविक उपसमूहहरू पनि पहिचान गरे। समग्रमा, यी परिणामहरू AD मा नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगहरूको लागि वेब-आधारित बायोमार्कर उपकरणहरूको लागि एक आशाजनक कदम हो।
अल्जाइमर रोग (AD) विश्वभरि न्यूरोडिजेनेरेटिभ डिमेन्शियाको सबैभन्दा सामान्य कारण हो र यो जैविक प्रणाली डिसफंक्शनको एक विस्तृत दायराद्वारा विशेषता हो, जसमा सिन्याप्टिक ट्रान्समिशन, ग्लियाल-मध्यस्थता प्रतिरोधात्मक क्षमता, र माइटोकोन्ड्रियल मेटाबोलिज्म (1-3) समावेश छ। जे होस्, यसको स्थापित प्रोटीन बायोमार्करहरू अझै पनि amyloid र tau प्रोटीन पत्ता लगाउन केन्द्रित छन्, र त्यसैले यो विविध pathophysiology प्रतिबिम्बित गर्न सक्दैन। यी "कोर" प्रोटीन बायोमार्करहरू जुन सबैभन्दा भरपर्दो रूपमा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) मा मापन गरिन्छ (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), जसले cortical amyloid plaques को गठन प्रतिबिम्बित गर्दछ; (ii) कुल टाउ, एक्सन डिजेनेरेशनको संकेत; (iii) phospho-tau (p-tau), पैथोलॉजिकल टाउ हाइपरफोस्फोरिलेशन का एक प्रतिनिधि (4-7)। यद्यपि यी सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्करहरूले हाम्रो "चिह्नित" एडी प्रोटीन रोगहरू (4-7) पत्ता लगाउन धेरै सुविधा दिएका छन्, तिनीहरूले रोगको पछाडि जटिल जीवविज्ञानको सानो अंश मात्र प्रतिनिधित्व गर्छन्।
AD बायोमार्करहरूको pathophysiological विविधताको अभावले धेरै चुनौतीहरू निम्त्याएको छ, जसमा (i) AD रोगीहरूको जैविक विषमता पहिचान गर्न र मापन गर्न असक्षमता, (ii) रोगको गम्भीरता र प्रगतिको अपर्याप्त मापन, विशेष गरी प्रिक्लिनिकल चरणमा, र ( iii) चिकित्सीय औषधिहरूको विकास जुन न्यूरोलॉजिकल बिग्रताका सबै पक्षहरूलाई पूर्ण रूपमा समाधान गर्न असफल भयो। सम्बन्धित रोगहरूबाट AD को वर्णन गर्न ल्यान्डमार्क रोगविज्ञानमा हाम्रो निर्भरताले यी समस्याहरूलाई मात्र बढाउँछ। अधिक र अधिक प्रमाणहरूले देखाउँछ कि डिमेन्सिया भएका अधिकांश वृद्धहरूमा संज्ञानात्मक गिरावटको एक भन्दा बढी रोगविज्ञान विशेषताहरू छन् (8)। AD रोगविज्ञान भएका ९०% वा सोभन्दा बढी व्यक्तिहरूलाई पनि भास्कुलर रोग, TDP-43 समावेश वा अन्य अपक्षयी रोगहरू (9) छन्। प्याथोलजिकल ओभरल्यापको यी उच्च अनुपातहरूले डिमेन्सियाको लागि हाम्रो वर्तमान निदान ढाँचामा बाधा पुर्‍याएको छ, र रोगको थप व्यापक प्याथोफिजियोलोजिकल परिभाषा आवश्यक छ।
विभिन्न प्रकारका AD बायोमार्करहरूको तत्काल आवश्यकतालाई ध्यानमा राख्दै, फिल्डले बायोमार्करहरू पत्ता लगाउन समग्र प्रणालीमा आधारित "ओमिक्स" विधिलाई बढाउँदै गइरहेको छ। Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance 2014 मा सुरु गरिएको थियो र यो कार्यक्रमको अगाडि छ। स्वास्थ्य, शिक्षा र उद्योगको राष्ट्रिय संस्थानहरू द्वारा यो बहु-अनुशासनात्मक प्रयासले AD को प्याथोफिजियोलोजीलाई अझ राम्रोसँग परिभाषित गर्न र जैव विविधता निदान विश्लेषण र उपचार रणनीतिहरू विकास गर्न प्रणाली-आधारित रणनीतिहरू प्रयोग गर्ने लक्ष्य राख्छ (10)। यस परियोजनाको एक भागको रूपमा, नेटवर्क प्रोटोमिक्स AD मा प्रणाली-आधारित बायोमार्करहरूको प्रगतिको लागि एक आशाजनक उपकरण भएको छ। यो निष्पक्ष डेटा-संचालित दृष्टिकोणले जटिल प्रोटोमिक्स डेटा सेटहरूलाई समूह वा सह-अभिव्यक्त प्रोटीनहरूको "मोड्युलहरू" मा व्यवस्थित गर्दछ जुन विशिष्ट सेल प्रकारहरू, अर्गानेल्स, र जैविक प्रकार्यहरूसँग सम्बन्धित छन् (11-13)। AD मस्तिष्क (13-23) मा लगभग 12 जानकारी युक्त नेटवर्क प्रोटोमिक्स अध्ययनहरू सञ्चालन गरिएको छ। समग्रमा, यी विश्लेषणहरूले संकेत गर्दछ कि AD मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटोमले स्वतन्त्र कोहोर्टहरू र बहु ​​कोर्टिकल क्षेत्रहरूमा उच्च संरक्षित मोड्युलर संगठन कायम गर्दछ। थप रूपमा, यी मोड्युलहरू मध्ये केहीले डेटा सेटहरूमा AD-सम्बन्धित प्रचुरतामा पुन: उत्पादन योग्य परिवर्तनहरू देखाउँदछ, धेरै रोगहरूको प्याथोफिजियोलोजीलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। सामूहिक रूपमा, यी निष्कर्षहरूले एडीमा प्रणाली-आधारित बायोमार्करको रूपमा मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटोमको खोजको लागि एक आशाजनक एंकर बिन्दु प्रदर्शन गर्दछ।
AD मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटोमलाई चिकित्सकीय रूपमा उपयोगी प्रणाली-आधारित बायोमार्करहरूमा रूपान्तरण गर्न, हामीले मस्तिष्क-व्युत्पन्न नेटवर्कलाई AD CSF को प्रोटोमिक विश्लेषणको साथ जोड्यौं। यो एकीकृत दृष्टिकोणले CSF बायोमार्करहरूको पाँच आशाजनक सेटहरूको पहिचान गर्न नेतृत्व गर्‍यो जुन मस्तिष्क-आधारित प्याथोफिजियोलोजीको विस्तृत श्रृंखलासँग सम्बन्धित छ, जसमा सिनेप्सेस, रक्त नलीहरू, माइलिनेसन, सूजन, र मेटाबोलिक मार्गहरूको डिसफंक्शन समावेश छ। हामीले यी बायोमार्कर प्यानलहरूलाई विभिन्न न्युरोडिजेनेरेटिभ रोगहरूबाट 500 भन्दा बढी CSF नमूनाहरू सहित बहु प्रतिकृति विश्लेषणहरू मार्फत सफलतापूर्वक मान्य गर्यौं। यी प्रमाणीकरण विश्लेषणहरूमा एसिम्प्टोमेटिक AD (AsymAD) भएका बिरामीहरूको CSF मा समूह लक्ष्यहरू जाँच गर्ने वा सामान्य संज्ञानात्मक वातावरणमा असामान्य amyloid संचयको प्रमाण देखाउने समावेश छ। यी विश्लेषणहरूले AsymAD जनसंख्यामा महत्त्वपूर्ण जैविक विषमतालाई हाइलाइट गर्दछ र प्यानल मार्करहरू पहिचान गर्दछ जसले रोगको प्रारम्भिक चरणहरूमा व्यक्तिहरूलाई उपप्रकार गर्न सक्षम हुन सक्छ। समग्रमा, यी नतिजाहरूले बहु प्रणालीहरूमा आधारित प्रोटीन बायोमार्कर उपकरणहरूको विकासमा एक प्रमुख चरण प्रतिनिधित्व गर्दछ जसले AD द्वारा सामना गरेका धेरै नैदानिक ​​​​चुनौतीहरूलाई सफलतापूर्वक समाधान गर्न सक्छ।
यस अध्ययनको मुख्य उद्देश्य नयाँ सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्करहरू पहिचान गर्नु हो जसले विभिन्न मस्तिष्क-आधारित प्याथोफिजियोलोजीलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ जसले AD लाई नेतृत्व गर्दछ। चित्र S1 ले हाम्रो अनुसन्धान पद्धतिलाई रूपरेखा दिन्छ, जसमा (i) AD CSF को प्रारम्भिक निष्कर्षहरू द्वारा संचालित एक व्यापक विश्लेषण र धेरै मस्तिष्क-सम्बन्धित CSF रोग बायोमार्करहरू पहिचान गर्न नेटवर्क ब्रेन प्रोटोम, र (ii) पछिको प्रतिकृति यी बायोमार्करहरू धेरै स्वतन्त्र सेरेब्रोस्पाइनलमा छन्। तरल समूह। आविष्कार-उन्मुख अनुसन्धान एमोरी गोइजुएटा अल्जाइमर रोग अनुसन्धान केन्द्र (ADRC) मा 20 संज्ञानात्मक सामान्य व्यक्ति र 20 AD बिरामीहरूमा CSF को भिन्नता अभिव्यक्तिको विश्लेषणको साथ सुरु भयो। AD को निदानलाई कम Aβ1-42 र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा कुल tau र p-tau को उच्च स्तरको उपस्थितिमा एक महत्वपूर्ण संज्ञानात्मक हानिको रूपमा परिभाषित गरिएको छ [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (तालिका S1A)। नियन्त्रण (मतलब MoCA, 26.7 ± 2.2) मा CSF बायोमार्करहरूको सामान्य स्तर थियो।
मानव CSF प्रोटीन प्रचुरता को एक गतिशील दायरा द्वारा विशेषता हो, जसमा एल्बुमिन र अन्य अत्यधिक प्रचुर मात्रामा प्रोटीनहरूले रुचि को प्रोटीन को पत्ता लगाउन रोक्न सक्छ (24)। प्रोटीन खोजको गहिराई बढाउनको लागि, हामीले मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण (24) अघि प्रत्येक CSF नमूनाबाट पहिलो 14 अत्यधिक प्रचुर मात्रामा प्रोटीनहरू हटायौं। MS द्वारा कुल 39,805 पेप्टाइडहरू पहिचान गरिएको थियो, जसलाई 40 नमूनाहरूमा 3691 प्रोटोमहरूमा म्याप गरिएको थियो। प्रोटीन परिमाणीकरण मल्टिपल ट्यान्डम मास ट्याग (TMT) लेबलिंग (18, 25) द्वारा गरिन्छ। हराइरहेको डाटा समाधान गर्नको लागि, हामीले ती प्रोटीनहरू मात्र समावेश गर्यौं जुन पछिको विश्लेषणमा नमूनाहरूको कम्तिमा 50% मा परिमाण गरिएको थियो, यसरी अन्ततः 2875 प्रोटोमहरू परिमाणमा। कुल प्रोटीन प्रचुरता स्तरहरूमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताको कारण, एक नियन्त्रण नमूनालाई सांख्यिकीय रूपमा बाहिरी (13) मानिएको थियो र पछिको विश्लेषणमा समावेश गरिएको थिएन। बाँकी 39 नमूनाहरूको प्रचुरता मानहरू उमेर, लिङ्ग, र ब्याच सहप्रसरण (13-15, 17, 18, 20, 26) अनुसार समायोजन गरियो।
रिग्रेसन डेटा सेटमा भिन्न अभिव्यक्तिको मूल्याङ्कन गर्न सांख्यिकीय t-परीक्षण विश्लेषण प्रयोग गर्दै, यो विश्लेषणले प्रोटीनहरू पहिचान गर्‍यो जसको प्रचुरता स्तरहरू नियन्त्रण र AD मामिलाहरू (तालिका S2A) बीचमा महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन भएको थियो (P <0.05)। चित्र 1A मा देखाइए अनुसार, AD मा कुल 225 प्रोटीनहरूको प्रचुरता उल्लेखनीय रूपमा घटेको थियो, र 303 प्रोटीनहरूको प्रशस्तता उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो। यी भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका प्रोटीनहरूमा धेरै पहिले पहिचान गरिएका सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड एडी मार्करहरू समावेश छन्, जस्तै माइक्रोट्यूब्युल-सम्बद्ध प्रोटीन टाउ (MAPT; P = 3.52 × 10−8), न्यूरोफिलामेन्ट (NEFL; P = 6.56 × 10−3), वृद्धि-सम्बन्धित प्रोटीन 43। (GAP43; P = 1.46 × 10−5), फ्याटी एसिड बाइन्डिङ प्रोटीन 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 like 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), न्यूरल ग्रानुलिन (NRGN; P = 3.43 × 10−4) र VGF तंत्रिका वृद्धि कारक (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6)। यद्यपि, हामीले अन्य धेरै महत्त्वपूर्ण लक्ष्यहरू पनि पहिचान गर्यौं, जस्तै GDP पृथक्करण अवरोधक 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) र SPARC-सम्बन्धित मोड्युलर क्याल्सियम बाइन्डिङ 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9)। 225 उल्लेखनीय रूपमा कम प्रोटीनहरूको जीन ओन्टोलजी (GO) विश्लेषणले स्टेरोइड मेटाबोलिज्म, रगत जम्ने र हर्मोन गतिविधि (चित्र 1B र तालिका S2B) जस्ता शरीरको तरल पदार्थ प्रक्रियाहरूसँग नजिकको सम्बन्ध प्रकट गर्‍यो। यसको विपरित, 303 को उल्लेखनीय रूपमा बढेको प्रोटीन सेल संरचना र ऊर्जा चयापचयसँग नजिकको सम्बन्ध छ।
(A) ज्वालामुखी प्लटले t-test द्वारा प्राप्त -log10 सांख्यिकीय P मान (y-axis) को सापेक्ष log2 तह परिवर्तन (x-axis) देखाउँछ, जुन नियन्त्रण (CT) र बीचको भिन्नता अभिव्यक्ति पत्ता लगाउन प्रयोग गरिन्छ। सबै प्रोटीनहरूको CSF प्रोटोमको एडी केसहरू। AD मा उल्लेखनीय रूपमा कम स्तर (P <0.05) भएका प्रोटिनहरू नीलो रंगमा देखाइन्छ, जबकि रोगमा उल्लेखनीय रूपमा बढेको स्तरहरू भएका प्रोटीनहरू रातो रंगमा देखाइन्छ। चयन गरिएको प्रोटीन लेबल गरिएको छ। (B) प्रोटीनसँग सम्बन्धित शीर्ष GO सर्तहरू AD मा उल्लेखनीय रूपमा कम (नीलो) र बढेको (रातो) छन्। जैविक प्रक्रियाहरू, आणविक कार्यहरू, र सेलुलर कम्पोनेन्टहरूको क्षेत्रमा उच्चतम z-स्कोरहरू भएका तीन GO सर्तहरू देखाउँदछ। (C) MS मापन गरिएको MAPT स्तर CSF नमूना (बायाँ) र नमूना ELISA tau स्तर (दायाँ) सँग यसको सम्बन्ध। सान्दर्भिक P मानको साथ Pearson सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित हुन्छ। एक AD मामिलाको लागि ELISA डाटाको कमीको कारण, यी तथ्याङ्कहरूले 39 विश्लेषण गरिएका केसहरू मध्ये 38 को लागि मानहरू समावेश गर्दछ। (D) नियन्त्रणमा पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण (P <0.0001, बेन्जामिनी-होचबर्ग (BH) समायोजित P <0.01) र AD CSF ले डेटा सेटमा 65 सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण परिवर्तन प्रोटीनहरू प्रयोग गरी नमूनाहरू फेला पार्यो। मानकीकरण, सामान्यीकरण।
MAPT को प्रोटोमिक स्तर स्वतन्त्र रूपमा मापन गरिएको ELISA tau स्तर (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; चित्र 1C), हाम्रो MS मापनको वैधतालाई समर्थन गर्दै नजिकबाट सम्बन्धित छ। Amyloid पूर्ववर्ती प्रोटीन (APP) को स्तरमा ट्रिप्सिन पाचन पछि, Aβ1-40 र Aβ1-42 को C-टर्मिनसमा म्याप गरिएको आइसोफर्म-विशिष्ट पेप्टाइडहरू कुशलतापूर्वक ionized गर्न सकिँदैन (27, 28)। तसर्थ, हामीले पहिचान गरेका APP पेप्टाइड्सको ELISA Aβ1-42 स्तरहरूसँग कुनै सम्बन्ध छैन। प्रत्येक केसको विभेदक अभिव्यक्तिको मूल्याङ्कन गर्नको लागि, हामीले P <0.0001 [False Discovery rate (FDR) सही P <0.01] सँग नमूनाहरू (तालिका S2A) को पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण गर्नको लागि भिन्न रूपमा व्यक्त प्रोटीनहरू प्रयोग गर्यौं। चित्र 1D मा देखाइए अनुसार, यी 65 अत्यधिक महत्त्वपूर्ण प्रोटीनहरूले रोग अवस्था अनुसार सही रूपमा क्लस्टर नमूनाहरू गर्न सक्छन्, नियन्त्रण-जस्तै विशेषताहरूको साथ एक AD केस बाहेक। यी 65 प्रोटीनहरू मध्ये, 63 AD मा बढ्यो, जबकि केवल दुई (CD74 र ISLR) घट्यो। कुलमा, यी सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड विश्लेषणहरूले एडीमा सयौं प्रोटीनहरू पहिचान गरेका छन् जसले रोग बायोमार्करहरूको रूपमा काम गर्न सक्छ।
त्यसपछि हामीले एडी ब्रेन प्रोटोमको स्वतन्त्र नेटवर्क विश्लेषण गर्यौं। यस खोजको मस्तिष्क समूहमा नियन्त्रण (n = 10), पार्किन्सन रोग (PD; n = 10), मिश्रित AD/PD (n = 10) र AD (n = 10) केसहरूबाट डोर्सोलेटरल प्रिफ्रन्टल कोर्टेक्स (DLPFC) समावेश थियो। ) नमूना। Emery Goizueta ADRC। यी 40 केसहरूको जनसांख्यिकी पहिले वर्णन गरिएको छ (25) र तालिका S1B मा संक्षेप गरिएको छ। हामीले TMT-MS प्रयोग गर्यौं यी 40 मस्तिष्क ऊतकहरू र 27 केसहरूको प्रतिकृति कोहोर्टको विश्लेषण गर्न। कुलमा, यी दुई मस्तिष्क डेटा सेटहरूले 227,121 अद्वितीय पेप्टाइडहरू उत्पादन गरे, जुन 12,943 प्रोटोमहरू (25) मा म्याप गरिएको थियो। कम्तिमा 50% मामिलाहरूमा परिमाणित भएका प्रोटिनहरूलाई मात्र पछिको अनुसन्धानमा समावेश गरिएको थियो। अन्तिम खोज डेटा सेटमा 8817 मात्रामा प्रोटीनहरू छन्। उमेर, लिङ्ग, र पोस्ट-मार्टम अन्तराल (PMI) को आधारमा प्रोटीन प्रचुर मात्रा समायोजन गर्नुहोस्। रिग्रेसन पछि सेट गरिएको डाटाको विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषणले देखायो कि > 2000 प्रोटीन स्तरहरू दुई वा बढी रोग समूहहरूमा [P <0.05, भिन्नताको विश्लेषण (ANOVA)] परिवर्तन भएको थियो। त्यसोभए, हामीले भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका प्रोटिनहरू, र P <0.0001 AD/control र/वा AD/PD तुलनाहरू (चित्र S2, A र B, Table S2C) मा आधारित एक पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण प्रदर्शन गर्यौं। यी 165 अत्यधिक परिवर्तन प्रोटीनहरूले नियन्त्रण र PD नमूनाहरूबाट AD रोगविज्ञानका साथ केसहरू स्पष्ट रूपमा चित्रण गर्दछ, सम्पूर्ण प्रोटोममा बलियो AD-विशिष्ट परिवर्तनहरूको पुष्टि गर्दै।
हामीले त्यसपछि पत्ता लगाइएको ब्रेन प्रोटोममा नेटवर्क विश्लेषण गर्न Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) भनिने एल्गोरिदम प्रयोग गर्‍यौं, जसले समान अभिव्यक्ति ढाँचाहरू (11-13) सँग प्रोटीन मोड्युलहरूमा डेटा सेटलाई व्यवस्थित गर्दछ। विश्लेषणले 44 मोड्युलहरू (M) सह-अभिव्यक्त प्रोटीनहरू पहिचान गर्यो, क्रमबद्ध र सबैभन्दा ठूलो (M1, n = 1821 प्रोटीनहरू) बाट सबैभन्दा सानो (M44, n = 34 प्रोटीनहरू) (चित्र 2A र तालिका S2D) सम्म। माथि उल्लेख गरिए अनुसार (१३) प्रत्येक मोड्युलको प्रतिनिधि अभिव्यक्ति प्रोफाइल वा विशेषता प्रोटिन गणना गर्नुहोस्, र यसलाई रोग अवस्था र AD रोगविज्ञानसँग सम्बद्ध गर्नुहोस्, अर्थात्, अल्जाइमर रोग रजिस्ट्री (CERAD) र Braak स्कोर (चित्र 2B) को गठबन्धन स्थापना गर्नुहोस्। समग्रमा, 17 मोड्युलहरू AD न्यूरोपैथोलोजी (P <0.05) सँग सम्बन्धित थिए। यी मध्ये धेरै रोग-सम्बन्धित मोड्युलहरू सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करहरूमा पनि धनी छन् (चित्र 2B)। माथि उल्लेख गरिए अनुसार (१३), सेल प्रकार संवर्धन मोड्युल ओभरल्याप र सेल प्रकार-विशिष्ट जीनहरूको सन्दर्भ सूचीको विश्लेषण गरेर निर्धारण गरिन्छ। यी जीनहरू पृथक माउस न्यूरोन्स, एन्डोथेलियल र ग्लियल सेलहरूमा प्रकाशित डाटाबाट व्युत्पन्न हुन्छन्। RNA अनुक्रमण (RNA-seq) प्रयोग (29)।
(A) मस्तिष्क प्रोटोमको WGCNA पत्ता लगाउनुहोस्। (B) CERAD (Aβ प्लेक) र Braak (tau tangles) स्कोर सहित एडी न्यूरोपैथोलॉजिकल विशेषताहरू (शीर्ष) को साथ मोड्युलर हस्ताक्षर प्रोटीन (मोड्युलर प्रोटीन अभिव्यक्तिको पहिलो प्रमुख घटक) को बायवेट मिडकोरिलेसन (BiCor) विश्लेषण। सकारात्मक (रातो) र नकारात्मक (नीलो) सहसम्बन्धको तीव्रता दुई-रङ ताप नक्सा द्वारा देखाइएको छ, र ताराहरूले सांख्यिकीय महत्त्व (P <0.05) संकेत गर्दछ। प्रत्येक प्रोटीन मोड्युलको सेल प्रकार एसोसिएशन मूल्याङ्कन गर्न Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (तल) प्रयोग गर्नुहोस्। रातो छायांकन को तीव्रता कोशिका प्रकार संवर्धन को डिग्री को संकेत गर्दछ, र तारा चिन्ह सांख्यिकीय महत्व को संकेत गर्दछ (P <0.05)। FET बाट व्युत्पन्न P मान सच्याउन BH विधि प्रयोग गर्नुहोस्। (C) मोड्युलर प्रोटीनहरूको GO विश्लेषण। प्रत्येक मोड्युल वा सम्बन्धित मोड्युल समूहका लागि सबैभन्दा नजिकबाट सम्बन्धित जैविक प्रक्रियाहरू देखाइन्छ। oligo, oligodendrocyte।
पाँच घनिष्ठ सम्बन्धित एस्ट्रोसाइट र माइक्रोग्लिया-रिच मोड्युलहरूको सेट (M30, M29, M18, M24, र M5) ले AD न्यूरोपैथोलोजी (चित्र 2B) सँग बलियो सकारात्मक सम्बन्ध देखायो। ओन्टोलजी विश्लेषणले यी ग्लियल मोड्युलहरूलाई कोशिकाको वृद्धि, प्रसार, र प्रतिरक्षा (चित्र 2C र तालिका S2E) सँग जोड्दछ। दुई अतिरिक्त ग्लियल मोड्युलहरू, M8 र M22, पनि रोगमा कडा रूपमा अपरेगुलेट गरिएका छन्। M8 अत्यधिक टोल-जस्तो रिसेप्टर मार्गसँग सम्बन्धित छ, एक सिग्नलिङ क्यास्केड जसले जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (30) मा मुख्य भूमिका खेल्छ। एकै समयमा, M22 पोस्ट-अनुवादात्मक परिमार्जनसँग नजिकको सम्बन्ध छ। M2, जो oligodendrocytes मा धनी छ, AD रोगविज्ञान संग एक बलियो सकारात्मक सम्बन्ध र nucleoside संश्लेषण र DNA प्रतिकृति संग एक ओन्टोलॉजिकल सम्बन्ध देखाउँछ, रोगहरु मा बृद्धि सेल प्रसार को संकेत गर्दछ। समग्रमा, यी खोजहरूले glial मोड्युलहरूको उचाइलाई समर्थन गर्दछ जुन हामीले पहिले AD नेटवर्क प्रोटोम (13, 17) मा अवलोकन गरेका छौं। यो हाल फेला परेको छ कि नेटवर्कमा धेरै AD-सम्बन्धित glial मोड्युलहरूले नियन्त्रण र PD मामिलाहरूमा कम अभिव्यक्ति स्तरहरू देखाउँछन्, तिनीहरूको रोग विशिष्टतालाई हाइलाइट गर्दै जुन AD (चित्र S2C) मा बढेको छ।
हाम्रो नेटवर्क प्रोटोम (M1, M3, M10, र M32) मा केवल चार मोड्युलहरू AD रोगविज्ञान (P <0.05) (चित्र 2, B र C) सँग कडा रूपमा नकारात्मक रूपमा सहसंबद्ध छन्। M1 र M3 दुबै न्यूरोनल मार्करहरूमा धनी छन्। M1 अत्यधिक सिनेप्टिक संकेतहरूसँग सम्बन्धित छ, जबकि M3 माइटोकोन्ड्रियल प्रकार्यसँग नजिक छ। M10 र M32 को लागि सेल प्रकार संवर्धनको कुनै प्रमाण छैन। M32 ले M3 र सेल चयापचय बीचको सम्बन्धलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, जबकि M10 अत्यधिक सेल वृद्धि र माइक्रोट्यूब्युल प्रकार्यसँग सम्बन्धित छ। AD को तुलनामा, सबै चार मोड्युलहरू नियन्त्रण र PD मा बढाइएको छ, तिनीहरूलाई रोग-विशिष्ट AD परिवर्तनहरू (चित्र S2C) दिँदै। समग्रमा, यी नतिजाहरूले न्यूरोन-अमीर मोड्युलहरूको कम प्रचुरतालाई समर्थन गर्दछ जुन हामीले पहिले AD (13, 17) मा अवलोकन गरेका छौं। संक्षेपमा, हामीले पत्ता लगाएको मस्तिष्क प्रोटोमको नेटवर्क विश्लेषणले AD-विशेष रूपमा परिवर्तन गरिएका मोड्युलहरू हाम्रो अघिल्लो निष्कर्षहरूसँग मिल्दोजुल्दो छ।
AD एक प्रारम्भिक एसिम्प्टोमेटिक चरण (AsymAD) द्वारा विशेषता हो, जसमा व्यक्तिहरूले क्लिनिकल संज्ञानात्मक गिरावट बिना एमाइलाइड संचय प्रदर्शन गर्दछ (5, 31)। यो एसिम्प्टोमेटिक चरणले प्रारम्भिक पहिचान र हस्तक्षेपको लागि एक महत्वपूर्ण विन्डो प्रतिनिधित्व गर्दछ। हामीले पहिले नै स्वतन्त्र डेटा सेटहरूमा AsymAD र AD मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटोमको बलियो मोड्युलर संरक्षण प्रदर्शन गरेका छौं (13, 17)। हामीले हाल पत्ता लगाएको मस्तिष्क सञ्जाल यी अघिल्लो खोजहरूसँग अनुरूप छ भनी सुनिश्चित गर्न, हामीले 27 DLPFC संस्थाहरूबाट प्रतिकृत डाटा सेटमा 44 मोड्युलहरूको संरक्षणको विश्लेषण गर्यौं। यी संगठनहरूमा नियन्त्रण (n = 10), AsymAD (n = 8) र AD (n = 9) केसहरू समावेश छन्। नियन्त्रण र AD नमूनाहरू हाम्रो खोज मस्तिष्क कोहोर्ट (तालिका S1B) को विश्लेषणमा समावेश गरिएको थियो, जबकि AsymAD केसहरू प्रतिकृति कोहोर्टमा मात्र अद्वितीय थिए। यी AsymAD केसहरू Emory Goizueta ADRC मस्तिष्क बैंकबाट पनि आएका थिए। यद्यपि मृत्युको समयमा अनुभूति सामान्य थियो, amyloid स्तर असामान्य रूपमा उच्च थियो (मतलब CERAD, 2.8 ± 0.5) (तालिका S1B)।
यी 27 मस्तिष्क तन्तुहरूको TMT-MS विश्लेषणले 11,244 प्रोटोमहरूको परिमाणमा परिणाम ल्यायो। यो अन्तिम गणनामा कम्तिमा 50% नमूनाहरूमा परिमाणित प्रोटीनहरू मात्र समावेश छन्। यस प्रतिकृति डेटा सेटले हाम्रो खोज मस्तिष्क विश्लेषणमा पत्ता लगाइएको 8817 प्रोटीनहरू मध्ये 8638 (98.0%) समावेश गर्दछ, र नियन्त्रण र AD कोहोर्टहरू (P <0.05, भिन्नताको विश्लेषणको लागि Tukey को जोडी t परीक्षण पछि) बीच लगभग 3000 उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन गरिएको प्रोटीनहरू छन्। तालिका S2F)। यी भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका प्रोटीनहरू मध्ये, 910 ले AD र मस्तिष्क प्रोटोम नियन्त्रण केसहरू (P <0.05, ANOVA Tukey जोडी t-test पछि) बीचको महत्त्वपूर्ण स्तर परिवर्तनहरू देखाउँदछ। यो ध्यान दिन लायक छ कि यी 910 मार्करहरू प्रोटोमहरू (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (चित्र S3A) बीचको परिवर्तनको दिशामा अत्यधिक संगत छन्। बढेको प्रोटिनहरू मध्ये, डाटा सेटहरू बीच सबैभन्दा लगातार परिवर्तन भएका प्रोटीनहरू मुख्यतया glial-rich M5 र M18 मोड्युलहरू (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, र GFAP) का सदस्य हुन्। घटाइएको प्रोटिनहरू मध्ये, सबैभन्दा लगातार परिवर्तन भएकाहरू लगभग विशेष रूपमा M1 मोड्युलका सदस्यहरू (NPTX2, VGF, र RPH3A) synapse सँग सम्बन्धित थिए। हामीले मिडकाइन (MDK), CD44, secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1) र VGF को पश्चिमी ब्लोटिंग (चित्र S3B) को AD-सम्बन्धित परिवर्तनहरू थप प्रमाणित गर्‍यौं। मोड्युल संरक्षण विश्लेषणले देखाएको छ कि मस्तिष्क प्रोटोममा लगभग 80% प्रोटीन मोड्युलहरू (34/44) प्रतिकृति डेटा सेट (z-score> 1.96, FDR सही P <0.05) (चित्र S3C) मा महत्त्वपूर्ण रूपमा संरक्षित थिए। यी मध्ये चौध मोड्युलहरू दुई प्रोटोमहरू (z-score> 10, FDR सही P <1.0 × 10−23) बीच विशेष रूपमा आरक्षित थिए। समग्रमा, मस्तिष्क प्रोटोम बीचको भिन्नता अभिव्यक्ति र मोड्युलर संरचनामा उच्च डिग्री स्थिरताको खोज र प्रतिकृतिले एडी फ्रन्टल कोर्टेक्स प्रोटीनहरूमा परिवर्तनहरूको पुन: उत्पादन क्षमतालाई हाइलाइट गर्दछ। थप रूपमा, यसले पनि पुष्टि गर्‍यो कि AsymAD र थप उन्नत रोगहरूमा धेरै समान मस्तिष्क नेटवर्क संरचना छ।
मस्तिष्क प्रतिकृति डेटा सेटमा भिन्नता अभिव्यक्तिको थप विस्तृत विश्लेषणले AsymAD प्रोटीन परिवर्तनहरूको महत्त्वपूर्ण डिग्रीलाई हाइलाइट गर्दछ, AsymAD र नियन्त्रण (P <0.05) (चित्र S3D) बीचको कुल 151 महत्त्वपूर्ण परिवर्तन प्रोटीनहरू सहित। Amyloid लोड संग संगत, AsymAD र AD को मस्तिष्क मा APP उल्लेखनीय वृद्धि भयो। MAPT केवल AD मा महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन हुन्छ, जुन ट्याङ्गल्सको बढेको स्तर र संज्ञानात्मक गिरावट (5, 7) संग यसको ज्ञात सहसंबंध संग संगत छ। ग्लियल-रिच मोड्युलहरू (M5 र M18) AsymAD मा बढेको प्रोटीनहरूमा अत्यधिक प्रतिबिम्बित हुन्छन्, जबकि न्यूरोन-सम्बन्धित M1 मोड्युल AsymAD मा घटेको प्रोटीनहरूको सबैभन्दा प्रतिनिधि हो। यी मध्ये धेरै AsymAD मार्करहरूले लक्षणात्मक रोगहरूमा ठूलो परिवर्तन देखाउँछन्। यी मार्करहरू मध्ये SMOC1, M18 सँग सम्बन्धित ग्लियल प्रोटीन हो, जुन मस्तिष्क ट्यूमर र आँखा र अंगहरूको विकाससँग सम्बन्धित छ (32)। MDK सेल वृद्धि र एंजियोजेनेसिस (33), M18 को अर्को सदस्यसँग सम्बन्धित हेपरिन-बाध्यकारी वृद्धि कारक हो। नियन्त्रण समूहको तुलनामा, AsymAD उल्लेखनीय रूपमा बढ्यो, पछि AD मा ठूलो वृद्धि भयो। यसको विपरीत, Synaptic प्रोटीन neuropentraxin 2 (NPTX2) AsymAD मस्तिष्कमा उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो। NPTX2 पहिले neurodegeneration संग सम्बन्धित थियो र उत्तेजक synapses (34) को मध्यस्थता मा एक मान्यता प्राप्त भूमिका छ। समग्रमा, यी नतिजाहरूले AD मा विभिन्न प्रकारका प्रिक्लिनिकल प्रोटीन परिवर्तनहरू प्रकट गर्दछ जुन रोगको गम्भीरतासँगै प्रगति भएको देखिन्छ।
हामीले मस्तिष्क प्रोटोमको खोजमा प्रोटीन कभरेजको महत्त्वपूर्ण गहिराइ हासिल गरेका छौं भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, हामी नेटवर्क-स्तर एडी ट्रान्सक्रिप्टोमसँग यसको ओभरल्यापलाई अझ पूर्ण रूपमा बुझ्न प्रयास गर्दैछौं। तसर्थ, हामीले एडी (n = 308) र नियन्त्रण (n = 157) DLPFC टिस्युहरू (13) मा 18,204 जीनहरूको माइक्रोएरे मापनबाट उत्पन्न गरेको मोड्युलसँग हामीले पत्ता लगाएको मस्तिष्क प्रोटोमलाई तुलना गर्यौं। अतिव्यापी। कुलमा, हामीले 20 फरक आरएनए मोड्युलहरू पहिचान गर्यौं, जसमध्ये धेरैले विशेष सेल प्रकारहरूको संवर्धन प्रदर्शन गर्‍यो, न्यूरोन्स, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स, र माइक्रोग्लिया (चित्र 3A) सहित। AD मा यी मोड्युलहरूको धेरै परिवर्तनहरू चित्र 3B मा देखाइएको छ। हाम्रो अघिल्लो प्रोटीन-आरएनए ओभरल्याप विश्लेषणसँग मिल्दोजुल्दो गहिरो लेबल नगरिएको MS प्रोटोम (लगभग 3000 प्रोटीनहरू) (13) को प्रयोग गरेर, हामीले फेला पारेका मस्तिष्क प्रोटोम नेटवर्कमा 44 मोड्युलहरू मध्ये धेरै जसो ट्रान्सक्रिप्टोम नेटवर्कमा छन्। त्यहाँ कुनै महत्त्वपूर्ण ओभरल्याप छैन। हाम्रो खोज र 34 प्रोटीन मोड्युलहरूको प्रतिकृति जुन मस्तिष्क प्रोटोममा अत्यधिक राखिएको छ, केवल 14 (~ 40%) ले फिशरको सटीक परीक्षण (FET) पास गरेको ट्रान्सक्रिप्टोम (चित्र 3A) सँग सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण ओभरल्याप भएको प्रमाणित भयो। DNA क्षति मर्मत (P-M25 र P-M19), प्रोटीन अनुवाद (P-M7 र P-M20), RNA बाइन्डिङ/स्प्लिसिङ (P-M16 र P-M21) र प्रोटीन लक्ष्यीकरण (P-M13 र P-) सँग उपयुक्त। M23) ट्रान्सक्रिप्टोममा मोड्युलहरूसँग ओभरल्याप गर्दैन। त्यसकारण, हालको ओभरल्याप विश्लेषण (13) मा गहिरो प्रोटोम डेटा सेट प्रयोग गरिए पनि, धेरै जसो AD नेटवर्क प्रोटोम ट्रान्सक्रिप्टोम नेटवर्कमा म्याप गरिएको छैन।
(A) Hypergeometric FET ले AD ट्रान्सक्रिप्टोम (शीर्ष) को RNA मोड्युलमा सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करहरूको संवर्धन र AD मस्तिष्कको RNA (x-axis) र प्रोटीन (y-axis) मोड्युलहरू बीचको ओभरल्यापको डिग्री देखाउँछ। (तल)। रातो छायांकनको तीव्रताले शीर्ष प्यानलमा सेल प्रकारहरूको संवर्धनको डिग्री र तल प्यानलमा मोड्युलहरूको ओभरल्यापको तीव्रतालाई संकेत गर्दछ। Asterisks ले सांख्यिकीय महत्व (P <0.05) लाई संकेत गर्दछ। (B) प्रत्येक ट्रान्सक्रिप्टोम मोड्युल र AD स्थितिको विशेषता जीनहरू बीचको सम्बन्धको डिग्री। बायाँका मोड्युलहरू सबैभन्दा नकारात्मक रूपमा AD (नीलो) सँग सम्बन्धित छन्, र दायाँमा भएकाहरू AD (रातो) सँग सबैभन्दा सकारात्मक रूपमा सहसंबद्ध छन्। लग-रूपान्तरित BH-सही P मानले प्रत्येक सहसम्बन्धको सांख्यिकीय महत्त्वको डिग्रीलाई संकेत गर्छ। (C) साझा सेल प्रकार संवर्धनको साथ महत्त्वपूर्ण ओभरल्यापिङ मोड्युलहरू। (D) ओभरल्यापिङ मोड्युलमा लेबल गरिएको प्रोटीन (x-axis) र RNA (y-axis) को log2 तह परिवर्तनको सहसंबंध विश्लेषण। सान्दर्भिक P मानको साथ Pearson सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित हुन्छ। माइक्रो, माइक्रोग्लिया; खगोलीय पिण्ड, एस्ट्रोसाइट्स। सीटी, नियन्त्रण।
धेरै जसो ओभरल्यापिङ प्रोटीन र आरएनए मोड्युलहरूले समान सेल प्रकार संवर्धन प्रोफाइलहरू र लगातार AD परिवर्तन दिशाहरू साझा गर्छन् (चित्र 3, B र C)। अर्को शब्दमा, मस्तिष्क प्रोटोम (PM​1) को synapse-सम्बन्धित M1 मोड्युललाई तीन न्यूरोनल-सम्पन्न होमोलोगस RNA मोड्युलहरू (R-M1, R-M9 र R-M16) मा म्याप गरिएको छ, जुन AD मा दुवै देखाइएको छ। एक कम स्तर। त्यसैगरी, ग्लियल-रिच M5 र M18 प्रोटीन मोड्युलहरू एस्ट्रोसाइट्स र माइक्रोग्लियल मार्करहरू (R-M3, R-M7, र R-M10) मा समृद्ध RNA मोड्युलहरूसँग ओभरल्याप हुन्छन् र रोगहरू वृद्धिमा अत्यधिक संलग्न हुन्छन्। यी दुई डेटा सेटहरू बीचको साझा मोड्युलर सुविधाहरूले मस्तिष्क प्रोटोममा हामीले अवलोकन गरेका सेल प्रकार संवर्धन र रोग-सम्बन्धित परिवर्तनहरूलाई समर्थन गर्दछ। यद्यपि, हामीले यी साझा मोड्युलहरूमा व्यक्तिगत मार्करहरूको आरएनए र प्रोटीन स्तरहरू बीच धेरै महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू देख्यौं। यी ओभरल्यापिङ मोड्युलहरू (चित्र 3D) भित्र अणुहरूको प्रोटोमिक्स र ट्रान्सक्रिप्टोमिक्सको भिन्न अभिव्यक्तिको सहसंबंध विश्लेषणले यो असंगततालाई हाइलाइट गर्दछ। उदाहरण को लागी, APP र धेरै अन्य glial मोड्युल प्रोटीन (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, र SFRP1) ले AD प्रोटोममा उल्लेखनीय वृद्धि देखाएको छ, तर AD ट्रान्सक्रिप्टोममा लगभग कुनै परिवर्तन भएको छैन। यी प्रोटीन-विशिष्ट परिवर्तनहरू amyloid plaques (23, 35) सँग नजिकबाट सम्बन्धित हुन सक्छ, प्रोटोमलाई रोगविज्ञान परिवर्तनहरूको स्रोतको रूपमा हाइलाइट गर्दै, र यी परिवर्तनहरू ट्रान्सक्रिप्टोममा प्रतिबिम्बित नहुन सक्छ।
हामीले पत्ता लगाएका मस्तिष्क र CSF प्रोटोमहरू स्वतन्त्र रूपमा विश्लेषण गरेपछि, हामीले मस्तिष्क नेटवर्कको प्याथोफिजियोलोजीसँग सम्बन्धित AD CSF बायोमार्करहरू पहिचान गर्न दुई डेटा सेटहरूको विस्तृत विश्लेषण गरेका छौं। हामीले पहिले दुई प्रोटोमहरूको ओभरल्याप परिभाषित गर्नुपर्छ। यद्यपि यो व्यापक रूपमा स्वीकार गरिएको छ कि CSF ले AD मस्तिष्कमा न्यूरोकेमिकल परिवर्तनहरू प्रतिबिम्बित गर्दछ (4), AD मस्तिष्क र CSF प्रोटोम बीचको ओभरल्यापको सही डिग्री स्पष्ट छैन। हाम्रा दुई प्रोटोमहरूमा पत्ता लगाइएका साझा जीन उत्पादनहरूको संख्या तुलना गरेर, हामीले पत्ता लगायौं कि मस्तिष्कमा चिनिने प्रोटिनहरूको लगभग 70% (n = 1936) मस्तिष्कमा पनि परिमाण गरिएको थियो (चित्र 4A)। यी धेरै जसो ओभरल्यापिङ प्रोटीनहरू (n = 1721) खोज मस्तिष्क डेटा सेट (चित्र 4B) बाट 44 सह-अभिव्यक्ति मोड्युलहरू मध्ये एउटामा म्याप गरिएको छ। अपेक्षित रूपमा, छवटा ठूला मस्तिष्क मोड्युलहरू (M1 देखि M6) ले CSF ओभरल्यापको सबैभन्दा ठूलो मात्रा प्रदर्शन गर्यो। यद्यपि, त्यहाँ साना मस्तिष्क मोड्युलहरू छन् (उदाहरणका लागि, M15 र M29) जसले अप्रत्याशित रूपमा उच्च स्तरको ओभरल्याप प्राप्त गर्दछ, मस्तिष्क मोड्युल भन्दा दुई गुणा ठूलो। यसले हामीलाई मस्तिष्क र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बीचको ओभरल्याप गणना गर्न थप विस्तृत, सांख्यिकीय रूपमा संचालित विधि अपनाउन उत्प्रेरित गर्छ।
(A र B) खोज मस्तिष्क र CSF डाटा सेट ओभरल्यापमा पत्ता लगाइएको प्रोटीनहरू। यी ओभरल्यापिङ प्रोटीनहरू प्रायः मस्तिष्क सह-अभिव्यक्ति नेटवर्कको 44 सह-अभिव्यक्ति मोड्युलहरू मध्ये एकसँग सम्बन्धित छन्। (C) सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड प्रोटोम र ब्रेन नेटवर्क प्रोटोम बीचको ओभरल्याप पत्ता लगाउनुहोस्। ताप नक्साको प्रत्येक पङ्क्तिले हाइपरजियोमेट्रिक FET को एक अलग ओभरल्याप विश्लेषण प्रतिनिधित्व गर्दछ। शीर्ष पङ्क्तिले मस्तिष्क मोड्युल र सम्पूर्ण CSF प्रोटोम बीचको ओभरल्याप (खैरो/कालो छायांकन) चित्रण गर्दछ। दोस्रो पङ्क्तिले मस्तिष्क मोड्युलहरू र CSF प्रोटीन (रातोमा छायादार) बीचको ओभरल्याप AD (P <0.05) मा उल्लेखनीय रूपमा माथि-विनियमित भएको देखाउँछ। तेस्रो पङ्क्तिले देखाउँछ कि मस्तिष्क मोड्युलहरू र CSF प्रोटीन (नीलो छायांकन) बीचको ओभरल्याप AD (P <0.05) मा महत्त्वपूर्ण रूपमा डाउन-रेगुलेट गरिएको छ। FET बाट व्युत्पन्न P मान सच्याउन BH विधि प्रयोग गर्नुहोस्। (D) सेल प्रकार संघ र सम्बन्धित GO सर्तहरूमा आधारित फोल्डिङ मोड्युल प्यानल। यी प्यानलहरूमा कुल 271 मस्तिष्क-सम्बन्धित प्रोटीनहरू छन्, जसको CSF प्रोटोममा अर्थपूर्ण भिन्नता अभिव्यक्ति छ।
एकल-पुच्छर FETs प्रयोग गरेर, हामीले CSF प्रोटोम र व्यक्तिगत मस्तिष्क मोड्युलहरू बीचको प्रोटीन ओभरल्यापको महत्त्वलाई मूल्याङ्कन गर्यौं। विश्लेषणले पत्ता लगायो कि CSF डेटा सेटमा कुल 14 मस्तिष्क मोड्युलहरूमा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण ओभरल्यापहरू छन् (FDR समायोजित P <0.05), र एक अतिरिक्त मोड्युल (M18) जसको ओभरल्याप महत्त्वको नजिक छ (FDR समायोजित P = 0.06) (चित्र 4C) , शीर्ष पङ्क्ति)। हामी मोड्युलहरूमा पनि रुचि राख्छौं जुन भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको CSF प्रोटीनहरूसँग दृढतापूर्वक ओभरल्याप हुन्छ। त्यसकारण, हामीले कुन (i) CSF प्रोटीन AD मा उल्लेखनीय रूपमा बढेको र (ii) CSF प्रोटीन AD मा उल्लेखनीय रूपमा घटेको निर्धारण गर्न दुई अतिरिक्त FET विश्लेषणहरू लागू गर्‍यौं (P <0.05, जोडी t test AD/control) अर्थपूर्ण ओभरल्यापको साथ मस्तिष्क मोड्युलहरू। तिनीहरू बीच। चित्र 4C को मध्य र तल्लो पङ्क्तिहरूमा देखाइए अनुसार, यी अतिरिक्त विश्लेषणहरूले AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, र M38) मा थपिएको प्रोटीनसँग 44 मस्तिष्क मोड्युलहरू उल्लेखनीय रूपमा ओभरल्याप भएको देखाउँछन्। । ), जबकि केवल दुई मोड्युलहरू (M6 र M15) ले AD CSF मा कम प्रोटीनको साथ अर्थपूर्ण ओभरल्याप देखायो। अपेक्षित रूपमा, सबै 10 मोड्युलहरू 15 मोड्युलहरूमा CSF प्रोटोमसँग उच्चतम ओभरल्याप भएका छन्। त्यसकारण, हामी मान्दछौं कि यी 15 मोड्युलहरू AD मस्तिष्क-व्युत्पन्न CSF बायोमार्करहरूको उच्च-उत्पादन स्रोतहरू हुन्।
हामीले यी 15 ओभरल्यापिङ मोड्युलहरूलाई WGCNA रूख रेखाचित्रमा उनीहरूको निकटता र सेल प्रकारहरू र जीन ओन्टोलजी (चित्र 4D) सँगको सम्बन्धमा आधारित पाँच ठूला प्रोटीन प्यानलहरूमा फोल्ड गर्यौं। पहिलो प्यानलमा न्यूरोन मार्करहरू र synapse-सम्बन्धित प्रोटीनहरू (M1 र M12) मा धनी मोड्युलहरू छन्। सिनाप्टिक प्यानलमा कुल 94 प्रोटीनहरू छन्, र CSF प्रोटोममा स्तरहरू महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन भएको छ, यसले पाँच प्यानलहरूमध्ये मस्तिष्क-सम्बन्धित CSF मार्करहरूको सबैभन्दा ठूलो स्रोत बनाउँछ। दोस्रो समूह (M6 र M15) ले एन्डोथेलियल सेल मार्करहरू र भास्कुलर शरीरसँग नजिकको सम्बन्ध प्रदर्शन गर्‍यो, जस्तै "घाउ निको पार्ने" (M6) र "ह्युमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाको नियमन" (M15)। M15 लेपोप्रोटिन चयापचयसँग पनि अत्यधिक सम्बन्धित छ, जुन एन्डोथेलियम (36) सँग नजिकबाट सम्बन्धित छ। भास्कुलर प्यानलले मस्तिष्कसँग सम्बन्धित 34 CSF मार्करहरू समावेश गर्दछ। तेस्रो समूहले मोड्युलहरू (M2 र M4) समावेश गर्दछ जुन महत्त्वपूर्ण रूपमा oligodendrocyte मार्करहरू र सेल प्रसारसँग सम्बन्धित छन्। उदाहरणका लागि, M2 को शीर्ष-स्तरीय ओन्टोलजी सर्तहरूमा "DNA प्रतिकृतिको सकारात्मक नियमन" र "purine biosynthesis प्रक्रिया" समावेश छ। यसैबीच, M4 मा "ग्लियल सेल भिन्नता" र "क्रोमोजोम अलगाव" समावेश छ। माइलिनेशन प्यानलले मस्तिष्कसँग सम्बन्धित ४९ CSF मार्करहरू समावेश गर्दछ।
चौथो समूहले सबैभन्दा धेरै मोड्युलहरू समावेश गर्दछ (M30, M29, M18, M24, र M5), र लगभग सबै मोड्युलहरू माइक्रोग्लिया र एस्ट्रोसाइट मार्करहरूमा उल्लेखनीय रूपमा धनी छन्। माइलिनेसन प्यानल जस्तै, चौथो प्यानलमा पनि मोड्युलहरू (M30, M29, र M18) समावेश छन् जुन सेल प्रसारसँग नजिकबाट सम्बन्धित छन्। यस समूहका अन्य मोड्युलहरू "प्रतिरक्षा प्रभाव प्रक्रिया" (M5) र "प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियमन" (M24) जस्ता इम्युनोलोजिकल सर्तहरूसँग अत्यधिक सम्बन्धित छन्। ग्लियाल प्रतिरक्षा समूहले मस्तिष्कसँग सम्बन्धित 42 CSF मार्करहरू समावेश गर्दछ। अन्तमा, अन्तिम प्यानलले चार मोड्युलहरू (M44, M3, M33, र M38) मा 52 मस्तिष्क-सम्बन्धित मार्करहरू समावेश गर्दछ, ती सबै ऊर्जा भण्डारण र चयापचयसँग सम्बन्धित शरीरमा छन्। यी मोड्युलहरू मध्ये सबैभन्दा ठूलो (M3) माइटोकोन्ड्रियासँग नजिक छ र न्यूरोन-विशिष्ट मार्करहरूमा धनी छ। M38 यस मेटाबोलोममा सानो मोड्युल सदस्यहरू मध्ये एक हो र यसले मध्यम न्यूरोन विशिष्टता पनि प्रदर्शन गर्दछ।
समग्रमा, यी पाँच प्यानलहरूले AD कोर्टेक्समा सेल प्रकार र कार्यहरूको विस्तृत दायरालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, र सामूहिक रूपमा 271 मस्तिष्क-सम्बन्धित CSF मार्करहरू (टेबल S2G) समावेश गर्दछ। यी एमएस नतिजाहरूको वैधता मूल्याङ्कन गर्नको लागि, हामीले निकटता विस्तार परख (पीईए), मल्टिप्लेक्सिङ क्षमताहरू, उच्च संवेदनशीलता र विशिष्टताको साथ एक अर्थोगोनल एन्टिबडी-आधारित प्रविधि प्रयोग गर्यौं, र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूनाहरूको पुनर्विश्लेषण गर्‍यौं जुन हामीले यी 271 बायोमार्करहरूको एक उपसमूह भेट्टायौं। (n = 36)। यी 36 लक्ष्यहरूले PEA को AD बहुमा परिवर्तन देखाउँछन्, जुन हाम्रो MS-आधारित निष्कर्षहरू (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) सँग नजिकबाट सम्बन्धित छ, जसले हाम्रो व्यापक MS विश्लेषण (चित्र S4) को परिणामहरूलाई दृढतापूर्वक प्रमाणित गर्‍यो। )।
हाम्रा पाँच समूहहरूद्वारा जोडिएका जैविक विषयवस्तुहरू, सिनेप्टिक संकेतदेखि ऊर्जा चयापचयसम्म, सबै AD (1-3) को रोगजननसँग सम्बन्धित छन्। त्यसकारण, यी प्यानलहरू भएका सबै 15 मोड्युलहरू हामीले पत्ता लगाएको मस्तिष्क प्रोटोममा AD रोगविज्ञानसँग सम्बन्धित छन् (चित्र 2B)। सबैभन्दा उल्लेखनीय हाम्रो ग्लियल मोड्युलहरू र हाम्रो सबैभन्दा ठूलो न्यूरोनल मोड्युलहरू (M1 र M3) बीचको बलियो नकारात्मक पैथोलॉजिकल सम्बन्ध बीचको उच्च सकारात्मक रोगविज्ञान सम्बन्ध हो। हाम्रो प्रतिकृति मस्तिष्क प्रोटोम (चित्र S3D) को विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषणले M5 र M18-व्युत्पन्न glial प्रोटीनहरू पनि हाइलाइट गर्दछ। AsymAD र symptomatic AD मा, सबैभन्दा बढेको glial प्रोटीन र M1-सम्बन्धित synapses प्रोटिन सबैभन्दा कम हुन्छ। यी अवलोकनहरूले संकेत गर्दछ कि हामीले पाँच समूहहरूमा पहिचान गरेका 271 सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मार्करहरू एडी कोर्टेक्समा रोग प्रक्रियाहरूसँग सम्बन्धित छन्, जुन प्रारम्भिक एसिम्प्टोमेटिक चरणहरूमा देखा पर्दछ।
मस्तिष्क र स्पाइनल फ्लुइडमा प्यानल प्रोटीनहरूको परिवर्तन दिशालाई राम्रोसँग विश्लेषण गर्नको लागि, हामीले प्रत्येक 15 ओभरल्यापिङ मोड्युलहरूको लागि निम्नलाई कोर्यौं: (i) मस्तिष्क डेटा सेटमा मोड्युल प्रचुरता स्तर फेला पर्‍यो र (ii) मोड्युल प्रोटीन भिन्नता सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (चित्र S5) मा व्यक्त गरिएको छ। पहिले उल्लेख गरिएझैं, WGCNA मस्तिष्कमा मोड्युल प्रचुरता वा विशेषता प्रोटीन मूल्य निर्धारण गर्न प्रयोग गरिन्छ (13)। ज्वालामुखी नक्सा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (एडी/नियन्त्रण) मा मोड्युलर प्रोटीनहरूको भिन्नता अभिव्यक्ति वर्णन गर्न प्रयोग गरिन्छ। यी तथ्याङ्कहरूले देखाउँछ कि पाँच प्यानल मध्ये तीनले मस्तिष्क र स्पाइनल फ्लुइडमा विभिन्न अभिव्यक्ति प्रवृत्तिहरू देखाउँछन्। Synapse प्यानल (M1 र M12) को दुई मोड्युलहरूले AD मस्तिष्कमा प्रचुरता स्तरमा कमी देखाउँछन्, तर AD CSF (चित्र S5A) मा बढेको प्रोटीनसँग महत्त्वपूर्ण रूपमा ओभरल्याप हुन्छ। मेटाबोलोम (M3 र M38) युक्त न्यूरोन-सम्बन्धित मोड्युलहरूले समान मस्तिष्क र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड अभिव्यक्ति ढाँचाहरू असंगत (चित्र S5E) देखाए। भास्कुलर प्यानलले विभिन्न अभिव्यक्ति प्रवृतिहरू पनि देखायो, यद्यपि यसको मोड्युलहरू (M6 र M15) AD मस्तिष्कमा मध्यम रूपमा बढेको थियो र रोगग्रस्त CSF (चित्र S5B) मा घटेको थियो। बाँकी दुई प्यानलहरूमा ठूला ग्लियल नेटवर्कहरू छन् जसको प्रोटिनहरू दुवै कम्पार्टमेन्टहरूमा लगातार अप-नियमित छन् (चित्र S5, C र D)।
कृपया ध्यान दिनुहोस् कि यी प्रवृतिहरू यी प्यानलहरूमा भएका सबै मार्करहरूमा सामान्य छैनन्। उदाहरणका लागि, सिनाप्टिक प्यानलले धेरै प्रोटीनहरू समावेश गर्दछ जुन AD मस्तिष्क र CSF (चित्र S5A) मा उल्लेखनीय रूपमा कम हुन्छ। यी डाउन-रेगुलेट गरिएको सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मार्करहरू मध्ये M1 को NPTX2 र VGF, र M12 को क्रोमोग्रानिन B छन्। यद्यपि, यी अपवादहरूको बावजुद, हाम्रा धेरै जसो सिनेप्टिक मार्करहरू एडी स्पाइनल फ्लुइडमा बढेका छन्। समग्रमा, यी विश्लेषणहरूले हाम्रा प्रत्येक पाँच प्यानलहरूमा मस्तिष्क र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड स्तरहरूमा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण प्रवृत्तिहरू छुट्याउन सक्षम थिए। यी प्रवृतिहरूले एडीमा मस्तिष्क र CSF प्रोटीन अभिव्यक्ति बीचको जटिल र प्रायः फरक सम्बन्धलाई हाइलाइट गर्दछ।
त्यसपछि, हामीले बायोमार्करहरूको 271 सेटलाई सबैभन्दा आशाजनक र पुन: उत्पादनयोग्य लक्ष्यहरू (चित्र 5A) मा सीमित गर्न उच्च-थ्रुपुट एमएस प्रतिकृति विश्लेषण (CSF प्रतिकृति 1) प्रयोग गर्यौं। CSF प्रतिलिपि 1 मा नियन्त्रण, AsymAD, र AD कोहोर्ट (तालिका S1A) सहित Emory Goizueta ADRC बाट कुल 96 नमूनाहरू समावेश छन्। यी AD मामिलाहरू हल्का संज्ञानात्मक गिरावट (मतलब MoCA, 20.0 ± 3.8), र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (टेबल S1A) मा पुष्टि भएको AD बायोमार्करहरूमा परिवर्तनहरू द्वारा विशेषता हो। हामीले फेला पारेको CSF विश्लेषणको विपरित, यो प्रतिकृति अधिक कुशल र उच्च-थ्रुपुट "एकल-शट" MS विधि (अफ-लाइन फ्र्याक्सेसन बिना) प्रयोग गरी गरिन्छ, एक सरल नमूना तयारी प्रोटोकल सहित जसले व्यक्तिगत नमूनाहरूको इम्युनोडिप्लेसनको आवश्यकतालाई हटाउँछ। । यसको सट्टा, कम प्रचुर मात्रामा प्रोटीनहरू (37) को संकेत विस्तार गर्न एकल प्रतिरक्षा-क्षय "बृद्धि च्यानल" प्रयोग गरिन्छ। यद्यपि यसले कुल प्रोटोम कभरेज घटाउँछ, यो एकल-शट विधिले मेसिनको समयलाई महत्त्वपूर्ण रूपमा घटाउँछ र TMT-लेबल गरिएको नमूनाहरूको संख्या बढाउँछ जुन व्यवहार्य विश्लेषण गर्न सकिन्छ (17, 38)। कुलमा, विश्लेषणले 6,487 पेप्टाइडहरू पहिचान गर्यो, जसले 96 मामिलाहरूमा 1,183 प्रोटोमहरूमा म्याप गर्यो। CSF विश्लेषणको रूपमा हामीले फेला पार्यौं, कम्तिमा 50% नमूनाहरूमा मात्र ती प्रोटीनहरू मात्र पछिको गणनामा समावेश गरिएको थियो, र डेटालाई उमेर र लिङ्गको प्रभावहरूको लागि रिग्रेस गरिएको थियो। यसले 792 प्रोटोमहरूको अन्तिम परिमाणीकरणको नेतृत्व गर्‍यो, जसमध्ये 95% CSF डाटा सेटमा पनि पहिचान गरिएको थियो।
(A) मस्तिष्क-सम्बन्धित CSF प्रोटीन लक्ष्यहरू पहिलो प्रतिकृति CSF कोहोर्टमा प्रमाणित र अन्तिम प्यानल (n = 60) मा समावेश गरियो। (B देखि E) प्यानल बायोमार्कर स्तरहरू (कम्पोजिट z-स्कोरहरू) चार CSF प्रतिकृति समूहहरूमा मापन गरियो। प्रत्येक प्रतिकृति विश्लेषणमा प्रचुर मात्रामा भएका परिवर्तनहरूको सांख्यिकीय महत्त्वको मूल्याङ्कन गर्न Tukey को पोस्ट-करेक्शनसँग जोडी t-परीक्षणहरू वा ANOVA प्रयोग गरियो। सीटी, नियन्त्रण।
हामी हाम्रो 271 मस्तिष्क-सम्बन्धित CSF लक्ष्यहरूलाई व्यापक विश्लेषणको माध्यमबाट प्रमाणित गर्नमा विशेष रुचि राखेकाले, हामी यी मार्करहरूमा यस प्रतिकृति प्रोटोमको थप परीक्षा सीमित गर्नेछौं। यी 271 प्रोटीनहरू मध्ये, 100 CSF प्रतिकृति 1 मा पत्ता लगाइयो। चित्र S6A ले नियन्त्रण र AD प्रतिकृति नमूनाहरू बीच यी 100 ओभरल्यापिङ मार्करहरूको भिन्नता अभिव्यक्ति देखाउँछ। Synaptic र metabolite हिस्टोनहरू AD मा सबैभन्दा बढि बढ्छ, जबकि भास्कुलर प्रोटीनहरू रोगमा सबैभन्दा कम हुन्छ। धेरै जसो 100 ओभरल्यापिङ मार्करहरू (n = 70) ले दुई डेटा सेटहरू (चित्र S6B) मा परिवर्तनको एउटै दिशा कायम राख्यो। यी 70 मान्य मस्तिष्क-सम्बन्धित CSF मार्करहरू (तालिका S2H) ले धेरै हदसम्म पहिले देखाइएको प्यानल अभिव्यक्ति प्रवृतिहरू प्रतिबिम्बित गर्दछ, त्यो हो, भास्कुलर प्रोटीनहरूको डाउन-रेगुलेसन र अन्य सबै प्यानलहरूको माथि-विनियमन। यी 70 मान्य प्रोटीनहरू मध्ये केवल 10 ले AD प्रचुरतामा परिवर्तनहरू देखाए जसले यी प्यानल प्रवृतिहरूलाई विरोध गर्यो। मस्तिष्क र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडको समग्र प्रवृतिलाई राम्रोसँग प्रतिबिम्बित गर्ने प्यानल उत्पन्न गर्न, हामीले अन्ततः प्रमाणित गरेको रुचिको प्यानलबाट यी 10 प्रोटिनहरू बाहिर राख्यौं (चित्र 5A)। तसर्थ, हाम्रो प्यानलले अन्ततः विभिन्न नमूना तयारी र MS प्लेटफर्म विश्लेषण प्रयोग गरेर दुई स्वतन्त्र CSF AD कोहोर्टहरूमा प्रमाणित गरी कुल 60 प्रोटीनहरू समावेश गर्दछ। CSF प्रतिलिपि 1 नियन्त्रण र AD मामिलाहरूमा यी अन्तिम प्यानलहरूको z-स्कोर अभिव्यक्ति प्लटहरूले हामीले फेला पारेको CSF कोहोर्टमा अवलोकन गरिएको प्यानल प्रवृत्ति पुष्टि गर्‍यो (चित्र 5B)।
यी 60 प्रोटीनहरू मध्ये, त्यहाँ AD सँग सम्बन्धित अणुहरू छन्, जस्तै osteopontin (SPP1), जुन एक प्रो-इन्फ्लेमेटरी साइटोकाइन हो जुन धेरै अध्ययनहरूमा AD सँग सम्बन्धित छ (39-41), र GAP43, एक synaptic प्रोटीन। जुन स्पष्ट रूपमा neurodegeneration (42) संग जोडिएको छ। सबैभन्दा पूर्ण रूपमा प्रमाणित प्रोटीनहरू अन्य न्यूरोडिजेनेरेटिभ रोगहरूसँग सम्बन्धित मार्करहरू हुन्, जस्तै एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (ALS) सम्बन्धित सुपरअक्साइड डिसमुटेज 1 (SOD1) र पार्किन्सन रोगसँग सम्बन्धित डेसाचरेस (PARK7)। हामीले यो पनि प्रमाणित गरेका छौं कि धेरै अन्य मार्करहरू, जस्तै SMOC1 र ब्रेन-रिच मेम्ब्रेन एट्याचमेन्ट सिग्नलिंग प्रोटीन 1 (BASP1), न्यूरोडिजेनरेशनमा अघिल्लो लिङ्कहरू सीमित छन्। यो ध्यान दिन लायक छ कि CSF प्रोटोममा तिनीहरूको कम समग्र प्रचुरताको कारणले गर्दा, MAPT र निश्चित अन्य AD-सम्बन्धित प्रोटीनहरू (उदाहरणका लागि, NEFL र NRGN) लाई विश्वसनीय रूपमा पत्ता लगाउन यो उच्च-थ्रुपुट एकल-शट पत्ता लगाउने विधि प्रयोग गर्न हामीलाई गाह्रो छ। ) (४३, ४४)।
हामीले त्यसपछि यी 60 प्राथमिकता प्यानल मार्करहरूलाई तीन अतिरिक्त प्रतिकृति विश्लेषणहरूमा जाँच गर्यौं। CSF प्रतिलिपि 2 मा, हामीले Emory Goizueta ADRC (17) बाट 297 नियन्त्रण र AD नमूनाहरूको स्वतन्त्र समूहको विश्लेषण गर्न एकल TMT-MS प्रयोग गर्यौं। CSF प्रतिकृति 3 मा 120 नियन्त्रणबाट उपलब्ध TMT-MS डेटा र लुसेन, स्विट्जरल्याण्ड (45) बाट एडी रोगीहरूको पुन: विश्लेषण समावेश थियो। हामीले प्रत्येक डेटासेटमा 60 प्राथमिकता मार्करहरूको दुई तिहाइ भन्दा बढी पत्ता लगायौं। यद्यपि स्विस अध्ययनले विभिन्न MS प्लेटफर्महरू र TMT क्वान्टिफिकेशन विधिहरू प्रयोग गर्‍यो (45, 46), हामीले हाम्रो प्यानल प्रवृत्तिहरूलाई दुई पटक दोहोरिएका विश्लेषणहरूमा पुन: उत्पादन गर्यौं (चित्र 5, C र D, र तालिकाहरू S2, I, र J)। हाम्रो समूहको रोग विशिष्टता मूल्याङ्कन गर्न, हामीले चौथो प्रतिकृति डेटा सेट (CSF प्रतिकृति 4) को विश्लेषण गर्न TMT-MS प्रयोग गर्‍यौं, जसमा नियन्त्रण (n = 18) र AD (n = 17) केसहरू मात्र समावेश थिएन, तर PD ( n = 14)), ALS (n = 18) र फ्रन्टोटेम्पोरल डिमेन्शिया (FTD) नमूनाहरू (n = 11) (तालिका S1A)। हामीले यस समूहमा प्यानल प्रोटीनहरूको लगभग दुई-तिहाई सफलतापूर्वक परिमाणित गर्‍यौं (38 मध्ये 60)। यी परिणामहरूले सबै पाँच बायोमार्कर प्यानलहरू (चित्र 5E र तालिका S2K) मा AD-विशिष्ट परिवर्तनहरू हाइलाइट गर्दछ। मेटाबोलाइट समूहमा भएको वृद्धिले सबैभन्दा बलियो AD विशिष्टता देखायो, त्यसपछि माइलिनेसन र ग्लियल समूह। थोरै हदसम्म, FTD ले यी प्यानलहरू बीचको वृद्धि पनि देखाउँदछ, जसले समान सम्भावित नेटवर्क परिवर्तनहरू प्रतिबिम्बित गर्न सक्छ (17)। यसको विपरित, ALS र PD ले नियन्त्रण समूहको रूपमा लगभग उस्तै माइलिनेसन, ग्लियल, र मेटाबोलोम प्रोफाइलहरू देखाए। समग्रमा, नमूना तयारी, MS प्लेटफर्म, र TMT क्वान्टिफिकेशन विधिहरूमा भिन्नता भए तापनि, यी दोहोर्याइएको विश्लेषणहरूले देखाउँदछ कि हाम्रो प्राथमिकता प्यानल मार्करहरूले 500 भन्दा बढी अद्वितीय CSF नमूनाहरूमा अत्यधिक सुसंगत AD-विशिष्ट परिवर्तनहरू छन्।
AD neurodegeneration को संज्ञानात्मक लक्षणहरु को शुरुवात धेरै वर्ष पहिले व्यापक रूपमा मान्यता प्राप्त भएको छ, त्यसैले AsymAD (5, 31) को बायोमार्कर को लागी तत्काल आवश्यकता छ। यद्यपि, अधिक र अधिक प्रमाणहरूले देखाउँदछ कि AsymAD को जीवविज्ञान एकरूपताबाट टाढा छ, र जोखिम र लचिलोपनको जटिल अन्तरक्रियाले पछिको रोगको प्रगतिमा ठूलो व्यक्तिगत भिन्नता निम्त्याउँछ (47)। AsymAD मामिलाहरू पहिचान गर्न प्रयोग भए तापनि, कोर CSF बायोमार्करहरू (Aβ1-42, कुल tau र p-tau) को स्तरहरूले डिमेन्सिया (4, 7) मा कसले प्रगति गर्नेछ भनेर भरपर्दो रूपमा भविष्यवाणी गर्न सक्षम भएको प्रमाणित गरेको छैन, यो थप हुन सक्छ। यस जनसंख्याको जोखिमलाई सही रूपमा स्तरीकरण गर्न मस्तिष्क फिजियोलोजीका बहु पक्षहरूमा आधारित समग्र बायोमार्कर उपकरणहरू समावेश गर्न आवश्यक छ। तसर्थ, हामीले पछि CSF प्रतिलिपि 1 को AsymAD जनसंख्यामा हाम्रो AD- मान्य बायोमार्कर प्यानलको विश्लेषण गर्‍यौं। यी 31 AsymAD केसहरूले असामान्य कोर बायोमार्कर स्तरहरू (Aβ1–42/कुल tau ELISA अनुपात, <5.5) र पूर्ण अनुभूति (मतलब MoCA, 27। ± 2.2) (तालिका S1A)। थप रूपमा, AsymAD भएका सबै व्यक्तिहरूको क्लिनिकल डिमेन्सिया स्कोर ० छ, जसले दैनिक संज्ञानात्मक वा कार्यात्मक कार्यसम्पादनमा गिरावटको कुनै प्रमाण छैन भनेर संकेत गर्दछ।
हामीले पहिले AsymAD कोहोर्ट सहित सबै 96 CSF प्रतिकृतिहरू 1 मा मान्य प्यानलहरूको स्तरहरू विश्लेषण गर्यौं। हामीले भेट्टायौं कि AsymAD समूहमा धेरै प्यानलहरूमा महत्त्वपूर्ण AD-जस्तै प्रचुरता परिवर्तनहरू थिए, भास्कुलर प्यानलले AsymAD मा तलको प्रवृत्ति देखायो, जबकि अन्य सबै प्यानलहरूले माथिल्लो प्रवृत्ति देखाए (चित्र 6A)। त्यसकारण, सबै प्यानलहरूले ELISA Aβ1-42 र कुल tau स्तरहरू (चित्र 6B) सँग अत्यधिक महत्त्वपूर्ण सम्बन्ध देखाए। यसको विपरित, समूह र MoCA स्कोर बीचको सम्बन्ध अपेक्षाकृत कमजोर छ। यी विश्लेषणहरूबाट थप उल्लेखनीय निष्कर्षहरू मध्ये एक AsymAD कोहोर्टमा प्यानल प्रचुरताहरूको ठूलो दायरा हो। चित्र 6A मा देखाइएको रूपमा, AsymAD समूहको प्यानल स्तर सामान्यतया नियन्त्रण समूह र AD समूहको प्यानल स्तर पार गर्दछ, अपेक्षाकृत उच्च परिवर्तनशीलता देखाउँदै। AsymAD को यस विषमतालाई थप अन्वेषण गर्न, हामीले 96 CSF प्रतिकृति 1 केसहरूमा बहुआयामिक स्केलिंग (MDS) विश्लेषण लागू गर्यौं। MDS विश्लेषणले डाटा सेटमा निश्चित चरहरूमा आधारित केसहरू बीचको समानता कल्पना गर्न अनुमति दिन्छ। यस क्लस्टर विश्लेषणको लागि, हामीले CSF खोज र प्रतिकृति 1 प्रोटोम (n = 29) (तालिका S2L) स्तरमा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण परिवर्तन (P <0.05, AD/control) भएका मान्य प्यानल मार्करहरू मात्र प्रयोग गर्छौं। यो विश्लेषणले हाम्रो नियन्त्रण र AD मामिलाहरू (चित्र 6C) बीच स्पष्ट स्थानिय क्लस्टरिङ उत्पादन गर्यो। यसको विपरित, केहि AsymAD केसहरू नियन्त्रण समूहमा स्पष्ट रूपमा क्लस्टर गरिएका छन्, जबकि अन्यहरू AD मामिलाहरूमा अवस्थित छन्। यस AsymAD heterogeneity को थप अन्वेषण गर्न, हामीले यी AsymAD मामिलाहरूको दुई समूह परिभाषित गर्न हाम्रो MDS नक्सा प्रयोग गर्यौं। पहिलो समूहले नियन्त्रण (n = 19) को नजिक क्लस्टर गरिएका AsymAD केसहरू समावेश गर्दछ, जबकि दोस्रो समूह AD (n = 12) को नजिक मार्कर प्रोफाइलको साथ AsymAD केसहरू द्वारा विशेषता थियो।
(A) AsymAD सहित CSF प्रतिकृति 1 कोहोर्टमा सबै 96 नमूनाहरूमा CSF बायोमार्कर समूहको अभिव्यक्ति स्तर (z-स्कोर)। Tukey को पोस्ट-सुधार संग भिन्नता को विश्लेषण प्यानल प्रचुरता परिवर्तन को सांख्यिकीय महत्व को मूल्याङ्कन गर्न को लागी प्रयोग गरिएको थियो। (B) प्यानल प्रोटीन प्रचुरता स्तर (z-स्कोर) को एमओसीए स्कोर र कुल टाउ स्तर ELISA Aβ1-42 र CSF प्रतिलिपि 1 नमूनाहरूको साथ विश्लेषण। सान्दर्भिक P मानको साथ Pearson सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित हुन्छ। (C) 96 CSF प्रतिलिपि 1 केसहरूको MDS 29 मान्य प्यानल मार्करहरूको प्रशस्तता स्तरहरूमा आधारित थियो, जुन दुवै खोज र CSF प्रतिलिपि 1 डेटा सेटहरू [P <0.05 AD/control (CT)] मा उल्लेखनीय रूपमा परिवर्तन भएको थियो। यो विश्लेषण AsymAD समूहलाई नियन्त्रण (n = 19) र AD (n = 12) उपसमूहहरूमा विभाजन गर्न प्रयोग गरिएको थियो। (D) ज्वालामुखी प्लटले दुई AsymAD उपसमूहहरू बीचको -log10 सांख्यिकीय P मानको सापेक्ष log2 तह परिवर्तन (x-axis) सँग सबै CSF प्रतिकृति 1 प्रोटीनहरूको भिन्नता अभिव्यक्ति देखाउँछ। प्यानल बायोमार्करहरू रंगीन छन्। (E) चयन समूह बायोमार्करहरूको CSF प्रतिकृति 1 प्रचुरता स्तर AsymAD उपसमूहहरू बीच फरक रूपमा व्यक्त गरिएको छ। Tukey को भिन्नता को पोस्ट-समायोजित विश्लेषण को सांख्यिकीय महत्व को आकलन को लागी प्रयोग गरिएको थियो।
हामीले यी नियन्त्रण र AD-जस्तो AsymAD केसहरू (चित्र 6D र तालिका S2L) बीचको भिन्न प्रोटीन अभिव्यक्तिको जाँच गर्यौं। परिणामस्वरूप ज्वालामुखी नक्साले देखाउँछ कि 14 प्यानल मार्करहरू दुई समूहहरू बीचमा महत्त्वपूर्ण परिवर्तन भएको छ। यी मार्करहरू प्रायः सिनेप्स र मेटाबोलोमका सदस्यहरू हुन्। यद्यपि, SOD1 र myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), जो क्रमशः माइलिन र glial प्रतिरक्षा समूहका सदस्य हुन्, यो समूह (चित्र 6, D र E) मा पर्दछन्। भास्कुलर प्यानलले दुई मार्करहरू पनि योगदान गर्‍यो जुन AD-जस्तो AsymAD समूहमा उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो, AE बाध्यकारी प्रोटीन 1 (AEBP1) र परिवार सदस्य C9 को पूरक सहित। ELISA AB1-42 (P = 0.38) र p-tau (P = 0.28) मा नियन्त्रण र AD-जस्तो AsymAD उपसमूहहरू बीच कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता थिएन, तर त्यहाँ वास्तवमा कुल tau स्तर (P = 0.0031) मा एक महत्त्वपूर्ण भिन्नता थियो। ) (चित्र S7)। त्यहाँ धेरै प्यानल मार्करहरू छन् जसले संकेत गर्दछ कि दुई AsymAD उपसमूहहरू बीचको परिवर्तनहरू कुल tau स्तरहरू (उदाहरणका लागि, YWHAZ, SOD1, र MDH1) (चित्र 6E) भन्दा बढी महत्त्वपूर्ण छन्। समग्रमा, यी नतिजाहरूले संकेत गर्दछ कि हाम्रो मान्य प्यानलमा बायोमार्करहरू हुन सक्छन् जसले एसिम्प्टोमेटिक रोग भएका बिरामीहरूको उपप्रकार र सम्भावित जोखिम स्तरीकरण गर्न सक्छ।
AD पछाडिको विभिन्न प्याथोफिजियोलोजीलाई राम्रोसँग मापन गर्न र लक्षित गर्न प्रणाली-आधारित बायोमार्कर उपकरणहरूको तत्काल आवश्यकता छ। यी उपकरणहरूले हाम्रो AD निदान ढाँचा मात्र परिवर्तन गर्दैन, तर प्रभावकारी, रोगी-विशेष उपचार रणनीतिहरू (1, 2) को अपनाउने प्रवर्द्धन गर्ने अपेक्षा गरिएको छ। यस अन्तको लागि, हामीले वेब-आधारित CSF बायोमार्करहरू पहिचान गर्न AD मस्तिष्क र CSF मा एक निष्पक्ष व्यापक प्रोटोमिक्स दृष्टिकोण लागू गर्‍यौं जसले मस्तिष्क-आधारित प्याथोफिजियोलोजीको विस्तृत दायरालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। हाम्रो विश्लेषणले पाँच CSF बायोमार्कर प्यानलहरू उत्पादन गर्यो, जसले (i) synapses, रक्त नलीहरू, माइलिन, प्रतिरक्षा र मेटाबोलिक डिसफंक्शनलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ; (ii) विभिन्न MS प्लेटफर्महरूमा बलियो प्रजनन क्षमता प्रदर्शन गर्नुहोस्; (iii) AD को प्रारम्भिक र अन्तिम चरणहरूमा प्रगतिशील रोग-विशेष परिवर्तनहरू देखाउनुहोस्। समग्रमा, यी खोजहरूले AD अनुसन्धान र क्लिनिकल अनुप्रयोगहरूको लागि विविध, भरपर्दो, वेब-उन्मुख बायोमार्कर उपकरणहरूको विकासको लागि एक आशाजनक कदम प्रतिनिधित्व गर्दछ।
हाम्रा नतिजाहरूले AD मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटोमको उच्च संरक्षित संगठन प्रदर्शन गर्दछ र प्रणाली-आधारित बायोमार्कर विकासको लागि एन्करको रूपमा यसको प्रयोगलाई समर्थन गर्दछ। हाम्रो विश्लेषणले देखाउँछ कि AD र AsymAD मस्तिष्कहरू भएका दुई स्वतन्त्र TMT-MS डेटासेटहरूमा बलियो मोडुलरिटी छ। यी निष्कर्षहरूले हाम्रो अघिल्लो काम विस्तार गर्दछ, फ्रन्टल, पार्इटल, र टेम्पोरल कोर्टेक्स (17) मा बहु ​​स्वतन्त्र कोहोर्टहरूबाट 2,000 भन्दा बढी मस्तिष्क ऊतकहरूको शक्तिशाली मोड्युलहरूको संरक्षण प्रदर्शन गर्दछ। यो सहमति नेटवर्कले हालको अनुसन्धानमा देखिएका विभिन्न रोग-सम्बन्धित परिवर्तनहरू प्रतिबिम्बित गर्दछ, जसमा ग्लियाल-रिच इन्फ्लेमेटरी मोड्युलहरूको वृद्धि र न्यूरोन-रिच मोड्युलहरूको कमी समावेश छ। हालको अनुसन्धान जस्तै, यो ठूला-ठूला नेटवर्कले AsymAD मा महत्वपूर्ण मोड्युलर परिवर्तनहरू पनि देखाउँदछ, विभिन्न प्रकारका विभिन्न पूर्व-प्राकृतिक रोगविज्ञान (17) देखाउँदै।
यद्यपि, यो अत्यधिक रूढिवादी प्रणाली-आधारित ढाँचा भित्र, त्यहाँ अधिक सूक्ष्म जैविक विविधता छ, विशेष गरी एडीको प्रारम्भिक चरणहरूमा व्यक्तिहरू बीच। हाम्रो बायोमार्कर प्यानलले AsymAD मा दुई उपसमूहहरू चित्रण गर्न सक्षम छ, जसले बहु CSF मार्करहरूको महत्त्वपूर्ण भिन्नता अभिव्यक्ति प्रदर्शन गर्दछ। हाम्रो समूहले यी दुई उपसमूहहरू बीचको जैविक भिन्नताहरू हाइलाइट गर्न सक्षम थियो, जुन कोर एडी बायोमार्करहरूको स्तरमा स्पष्ट थिएन। नियन्त्रण समूहको तुलनामा, यी AsymAD व्यक्तिहरूको Aβ1-42 / कुल टाउ अनुपात असामान्य रूपमा कम थियो। यद्यपि, केवल कुल tau स्तरहरू दुई AsymAD उपसमूहहरू बीच महत्त्वपूर्ण रूपमा भिन्न थिए, जबकि Aβ1-42 र p-tau स्तरहरू तुलनात्मक रूपमा तुलनात्मक रहे। उच्च CSF tau Aβ1-42 स्तरहरू (7) भन्दा संज्ञानात्मक लक्षणहरूको राम्रो भविष्यवाणी गर्ने देखिन्छ, हामीलाई शंका छ कि दुई AsymAD कोहोर्टहरूमा रोगको प्रगतिको फरक जोखिम हुन सक्छ। हाम्रो AsymAD को सीमित नमूना आकार र अनुदैर्ध्य डेटाको कमीलाई ध्यानमा राख्दै, यी निष्कर्षहरू आत्मविश्वासका साथ आकर्षित गर्न थप अनुसन्धान आवश्यक छ। यद्यपि, यी परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि प्रणाली-आधारित CSF प्यानलले रोगको एसिम्प्टोमेटिक चरणमा व्यक्तिहरूलाई प्रभावकारी रूपमा स्तरीकरण गर्ने हाम्रो क्षमता बढाउन सक्छ।
समग्रमा, हाम्रा खोजहरूले AD को रोगजननमा बहु जैविक कार्यहरूको भूमिकालाई समर्थन गर्दछ। यद्यपि, अनियमित ऊर्जा चयापचय हाम्रा सबै पाँच मान्य लेबलिङ प्यानलहरूको प्रमुख विषयवस्तु बन्यो। मेटाबोलिक प्रोटीनहरू, जस्तै hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) र lactate dehydrogenase A (LDHA), सबैभन्दा बलियो रूपमा मान्य सिनाप्टिक बायोमार्करहरू हुन्, जसले संकेत गर्दछ कि AD CSF मा वृद्धि अत्यधिक प्रजनन योग्य यौन हो। हाम्रो रक्त वाहिकाहरू र ग्लियल प्यानलहरूमा अक्सिडेटिभ पदार्थहरूको चयापचयमा संलग्न धेरै मार्करहरू पनि हुन्छन्। यी निष्कर्षहरू मुख्य भूमिकासँग मेल खान्छ जुन मेटाबोलिक प्रक्रियाहरूले सम्पूर्ण मस्तिष्कमा खेल्छन्, न केवल न्यूरोन्सको उच्च ऊर्जा माग पूरा गर्न, तर एस्ट्रोसाइट्स र अन्य ग्लियल सेलहरूको उच्च ऊर्जा माग पूरा गर्न पनि (17, 48)। हाम्रा नतिजाहरूले बढ्दो प्रमाणलाई समर्थन गर्दछ कि रेडक्स सम्भाव्यतामा परिवर्तनहरू र ऊर्जा मार्गहरूको अवरोध एडीको रोगजननमा संलग्न धेरै मुख्य प्रक्रियाहरू बीचको मुख्य लिङ्क हुन सक्छ, माइटोकोन्ड्रियल विकारहरू, ग्लियल-मध्यस्थ सूजन, र भास्कुलर क्षति (49)। थप रूपमा, मेटाबोलिक सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड बायोमार्करहरूले हाम्रो नियन्त्रण र AD-जस्तै AsymAD उपसमूहहरू बीच ठूलो संख्यामा भिन्न-भिन्न धनी प्रोटीनहरू समावेश गर्दछ, सुझाव दिन्छ कि यी ऊर्जा र रेडक्स मार्गहरूको अवरोध रोगको प्रिक्लिनिकल चरणमा महत्वपूर्ण हुन सक्छ।
हामीले अवलोकन गरेका विभिन्न मस्तिष्क र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड प्यानल प्रवृत्तिहरूमा पनि रोचक जैविक प्रभावहरू छन्। न्यूरोन्समा समृद्ध सिनेप्सेस र मेटाबोलोमहरूले एडी मस्तिष्कमा घटेको स्तर र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा प्रशस्तता बढेको देखाउँछन्। न्युरोनहरू तिनीहरूको असंख्य विशेष संकेतहरू (50) को लागि ऊर्जा प्रदान गर्न synapses मा ऊर्जा-उत्पादन mitochondria मा धनी छन्, यी दुई न्यूरोन समूहहरूको अभिव्यक्ति प्रोफाइलहरूको समानता अपेक्षा गरिएको छ। न्युरोन्सको हानि र क्षतिग्रस्त कोशिकाहरूको निकासीले पछिको रोगमा यी मस्तिष्क र CSF प्यानल प्रवृत्तिहरूको व्याख्या गर्न सक्छ, तर तिनीहरूले हामीले अवलोकन गरेका प्रारम्भिक प्यानल परिवर्तनहरू व्याख्या गर्न सक्दैनन् (13)। प्रारम्भिक एसिम्प्टोमेटिक रोगमा यी निष्कर्षहरूको लागि एक सम्भावित व्याख्या असामान्य सिनेप्टिक प्रुनिङ हो। माउस मोडेलहरूमा नयाँ प्रमाणहरूले सुझाव दिन्छ कि माइक्रोग्लिया-मध्यस्थ सिनाप्टिक फागोसाइटोसिस असामान्य रूपमा एडीमा सक्रिय हुन सक्छ र मस्तिष्कमा प्रारम्भिक सिनेप्स हानिको नेतृत्व गर्दछ (51)। यो खारेज गरिएको synaptic सामग्री CSF मा जम्मा हुन सक्छ, त्यसैले हामी न्यूरोन प्यानलमा CSF मा वृद्धि देख्छौं। इम्यून-मध्यस्थ सिनाप्टिक छाँट्नेले रोगको सम्पूर्ण प्रक्रियामा हामीले मस्तिष्क र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा देख्ने ग्लियल प्रोटीनको वृद्धिलाई आंशिक रूपमा व्याख्या गर्न सक्छ। Synaptic pruning को अतिरिक्त, exocytic pathway मा समग्र असामान्यताहरु को न्यूरोनल मार्कर को विभिन्न मस्तिष्क र CSF अभिव्यक्तिहरु लाई पनि नेतृत्व गर्न सक्छ। धेरै अध्ययनहरूले देखाएको छ कि AD मस्तिष्कको रोगजननमा exosomes को सामग्री परिवर्तन भएको छ (52)। बाह्य कोशिका मार्ग Aβ (53, 54) को प्रसारमा पनि संलग्न छ। यो ध्यान दिन लायक छ कि एक्सोसोमल स्रावको दमनले एडी ट्रान्सजेनिक माउस मोडेलहरूमा AD-जस्तो रोगविज्ञान कम गर्न सक्छ (55)।
एकै समयमा, भास्कुलर प्यानलमा प्रोटीनले AD मस्तिष्कमा मध्यम वृद्धि देखाएको छ, तर CSF मा उल्लेखनीय रूपमा घटेको छ। रगत-मस्तिष्क अवरोध (BBB) ​​डिसफंक्शनले यी निष्कर्षहरूलाई आंशिक रूपमा व्याख्या गर्न सक्छ। धेरै स्वतन्त्र पोस्टमार्टम मानव अध्ययनहरूले AD (56, 57) मा BBB ब्रेकडाउन देखाएको छ। यी अध्ययनहरूले मस्तिष्क केशिका चुहावट र रक्त-जन्म प्रोटीन (57) को पेरिभास्कुलर संचय सहित एन्डोथेलियल कोशिकाहरूको यो कडा रूपमा छापिएको तह वरपरका विभिन्न असामान्य गतिविधिहरूको पुष्टि गर्‍यो। यसले मस्तिष्कमा उच्च भास्कुलर प्रोटिनहरूको लागि सरल व्याख्या प्रदान गर्न सक्छ, तर यसले मस्तिष्कको तरल पदार्थमा यी समान प्रोटीनहरूको कमीलाई पूर्ण रूपमा व्याख्या गर्न सक्दैन। एउटा सम्भावना यो हो कि केन्द्रीय स्नायु प्रणाली सक्रिय रूपमा यी अणुहरूलाई बढेको सूजन र अक्सिडेटिभ तनावको समस्या समाधान गर्न अलग गर्दैछ। यस प्यानलका केही सबैभन्दा गम्भीर CSF प्रोटीनहरूमा कमी, विशेष गरी लिपोप्रोटिन नियमनमा संलग्नहरू, हानिकारक स्तरको सूजन र प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरूको न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रक्रियाको अवरोधसँग सम्बन्धित छ। यो Paroxonase 1 (PON1) को लागी सत्य हो, परिसंचरण (58, 59) मा अक्सिडेटिभ तनाव स्तर कम गर्न को लागी जिम्मेवार एक लिपोप्रोटिन बाध्यकारी इन्जाइम। Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) भास्कुलर समूहको अर्को महत्वपूर्ण रूपमा डाउन-रेगुलेट मार्कर हो। यो लिपिड ट्रान्सपोर्टर बिकुनिनको अग्रदूत हो, जुन सूजन दमन र न्यूरोलोजिकल संरक्षणमा पनि संलग्न छ (60, 61)।
विभिन्न रोचक परिकल्पनाहरूको बावजुद, जैव रासायनिक रोग संयन्त्रहरू प्रत्यक्ष रूपमा पत्ता लगाउन असक्षमता खोज-संचालित प्रोटोमिक्स विश्लेषणको एक ज्ञात सीमा हो। तसर्थ, यी बायोमार्कर प्यानलहरू पछाडि रहेका संयन्त्रहरूलाई आत्मविश्वासपूर्वक परिभाषित गर्न थप अनुसन्धान आवश्यक छ। MS-आधारित नैदानिक ​​​​विश्लेषणको विकास तर्फ अघि बढ्नको लागि, भविष्यको दिशालाई पनि ठूलो मात्रामा बायोमार्कर प्रमाणिकरणको लागि लक्षित मात्रात्मक विधिहरूको प्रयोग आवश्यक छ, जस्तै चयनात्मक वा समानान्तर प्रतिक्रिया निगरानी (62)। हामीले भर्खरै समानान्तर प्रतिक्रिया निगरानी (63) प्रयोग गर्यौं यहाँ वर्णन गरिएका धेरै CSF प्रोटीन परिवर्तनहरू मान्य गर्न। धेरै प्राथमिकता प्यानल लक्ष्यहरू YWHAZ, ALDOA, र SMOC1 सहित, क्रमशः हाम्रो सिनेप्स, चयापचय, र सूजन प्यानलहरूमा नक्सा सहित महत्त्वपूर्ण सटीकताको साथ परिमाणित छन् (63)। स्वतन्त्र डाटा अधिग्रहण (DIA) र अन्य MS-आधारित रणनीतिहरू पनि लक्ष्य प्रमाणिकरणको लागि उपयोगी हुन सक्छन्। Bud et al। (64) हालसालै यो प्रदर्शन गरिएको थियो कि हाम्रो CSF खोज डेटा सेट र स्वतन्त्र DIA-MS डेटा सेटमा पहिचान गरिएको AD बायोमार्करहरू बीचको महत्त्वपूर्ण ओभरल्याप छ, जसमा तीन फरक युरोपेली समूहहरूबाट लगभग 200 CSF नमूनाहरू समावेश छन्। यी भर्खरका अध्ययनहरूले भरपर्दो MS-आधारित पत्ता लगाउने हाम्रो प्यानलहरूको सम्भावनालाई समर्थन गर्दछ। परम्परागत एन्टिबडी र एप्टेमर-आधारित पत्ता लगाउने कुञ्जी AD बायोमार्करहरूको थप विकासको लागि पनि महत्त्वपूर्ण छ। CSF को कम प्रचुरताको कारण, उच्च-थ्रुपुट MS विधिहरू प्रयोग गरेर यी बायोमार्करहरू पत्ता लगाउन गाह्रो छ। NEFL र NRGN कम-प्रचुरता CSF बायोमार्करहरूको दुई उदाहरणहरू हुन्, जुन हाम्रो व्यापक विश्लेषणमा प्यानलमा म्याप गरिएको छ, तर हाम्रो एकल MS रणनीति प्रयोग गरेर विश्वसनीय रूपमा पत्ता लगाउन सकिँदैन। धेरै एन्टिबडीहरूमा आधारित लक्ष्यीकरण रणनीतिहरू, जस्तै PEA, यी मार्करहरूको क्लिनिकल रूपान्तरणलाई बढावा दिन सक्छ।
समग्रमा, यस अध्ययनले विभिन्न प्रणालीहरूमा आधारित CSF AD बायोमार्करहरूको पहिचान र प्रमाणीकरणको लागि एक अद्वितीय प्रोटोमिक्स दृष्टिकोण प्रदान गर्दछ। अतिरिक्त AD कोहोर्टहरू र MS प्लेटफर्महरूमा यी मार्कर प्यानलहरू अनुकूलन गर्दा AD जोखिम स्तरीकरण र उपचारलाई अगाडि बढाउने आशाजनक साबित हुन सक्छ। समयको साथमा यी प्यानलहरूको अनुदैर्ध्य स्तरको मूल्याङ्कन गर्ने अध्ययनहरू पनि मार्करहरूको कुन संयोजनले प्रारम्भिक रोगको जोखिम र रोगको गम्भीरतामा परिवर्तनहरूलाई उत्तम स्तरीकरण गर्छ भनेर निर्धारण गर्न महत्त्वपूर्ण हुन्छ।
CSF द्वारा प्रतिलिपि गरिएका 3 नमूनाहरू बाहेक, यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएका सबै CSF नमूनाहरू Emory ADRC वा नजिकका सम्बन्धित अनुसन्धान संस्थाहरूको संरक्षणमा सङ्कलन गरिएको थियो। एमोरी CSF नमूनाहरूको कुल चार सेटहरू यी प्रोटोमिक्स अध्ययनहरूमा प्रयोग गरियो। CSF कोहोर्टमा 20 स्वस्थ नियन्त्रण र 20 AD बिरामीहरूबाट नमूनाहरू समावेश भएको पाइयो। CSF प्रतिलिपि 1 मा 32 स्वस्थ नियन्त्रणहरू, 31 AsymAD व्यक्तिहरू, र 33 AD व्यक्तिहरूबाट नमूनाहरू समावेश छन्। CSF प्रतिलिपि 2 मा 147 नियन्त्रणहरू र 150 AD नमूनाहरू छन्। बहु-रोग CSF प्रतिकृति 4 कोहोर्टमा 18 नियन्त्रणहरू, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, र 11 FTD नमूनाहरू समावेश थिए। Emory विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित सम्झौता अनुसार, सबै Emory अध्ययन सहभागीहरूले सूचित सहमति प्राप्त गरे। 2014 नेशनल इन्स्टिच्युट अफ एजिङ बेस्ट प्रैक्टिस गाइडलाइन्स फर अल्जाइमर्स सेन्टरहरू (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) अनुसार, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडलाई लुम्बर पङ्क्चरद्वारा सङ्कलन र भण्डार गरिएको थियो। नियन्त्रण र AsymAD र AD बिरामीहरूले Emory Cognitive Neurology Clinic वा Goizueta ADRC मा मानकीकृत संज्ञानात्मक मूल्याङ्कन प्राप्त गरे। तिनीहरूको सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूनाहरू INNO-BIA AlzBio3 Luminex द्वारा ELISA Aβ1-42, कुल tau र p-tau विश्लेषण (65) को लागि परीक्षण गरिएको थियो। ELISA मानहरू स्थापित AD बायोमार्कर कट-अफ मापदण्ड (66, 67) मा आधारित विषयहरूको निदान वर्गीकरण समर्थन गर्न प्रयोग गरिन्छ। अन्य CSF निदानहरू (FTD, ALS, र PD) को लागि आधारभूत जनसांख्यिकीय र निदान डेटा पनि Emory ADRC वा सम्बद्ध अनुसन्धान संस्थाहरूबाट प्राप्त गरिन्छ। यी Emory CSF केसहरूको लागि सारांश केस मेटाडेटा तालिका S1A मा फेला पार्न सकिन्छ। स्विस CSF प्रतिकृति 3 कोहोर्ट को विशेषताहरु पहिले प्रकाशित गरिएको छ (45)।
CSF ले नमूना फेला पार्यो। CSF डेटा सेटको हाम्रो खोजको गहिराइ बढाउनको लागि, उच्च-प्रचुर मात्रामा प्रोटीनहरूको प्रतिरक्षा खपत ट्रिप्सिनाइजेशन अघि प्रदर्शन गरिएको थियो। छोटकरीमा, 40 व्यक्तिगत CSF नमूनाहरूबाट CSF को 130 μl र उच्च चयन Top14 प्रचुरता प्रोटीन डिप्लेशन रेसिन (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, A36372) को बराबर मात्रा (130 μl) स्पिन स्तम्भमा राखिएको थियो (थर्मो फिशर वैज्ञानिक, A89868) कोठामा। तापमान इन्क्यूबेट)। 15 मिनेटको लागि कताई पछि, 2 मिनेटको लागि 1000 ग्राम मा नमूना सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्। एक 3K अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूगल फिल्टर उपकरण (मिलीपुर, UFC500396) 30 मिनेटको लागि 14,000 ग्राम मा सेन्ट्रीफ्यूज गरेर फोहोर नमूना केन्द्रित गर्न प्रयोग गरिएको थियो। फस्फेट बफर गरिएको सलाइनको साथ 75 μl मा सबै नमूना मात्राहरू पतला गर्नुहोस्। प्रोटिन एकाग्रता निर्माताको प्रोटोकल (थर्मो फिशर वैज्ञानिक) अनुसार बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) विधि द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो। सबै 40 नमूनाहरूबाट इम्युनोडिप्लेटेड CSF (60 μl) लाई लाइसिल एन्डोपेप्टिडेज (LysC) र ट्रिप्सिनसँग पचाइएको थियो। छोटकरीमा, नमूनालाई 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine र 3 μl 0.8 M chloroacetamide 90 °C मा 10 मिनेटको लागि घटाइयो र alkylated गरिएको थियो, र त्यसपछि 15 मिनेटको लागि पानीको नुहाउने ठाउँमा sonicated। नमूनालाई 193 μl 8 M यूरिया बफर [8 M यूरिया र 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] 6 M यूरियाको अन्तिम एकाग्रतामा पातलो गरिएको थियो। LysC (4.5 μg; Wako) कोठाको तापक्रममा रातभरि पाचनका लागि प्रयोग गरिन्छ। त्यसपछि नमूनालाई 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (ABC) (68) संग 1 एम यूरियामा पातलो गरियो। ट्रिप्सिन (प्रोमेगा) को बराबर मात्रा (4.5 μg) थप्नुहोस्, र त्यसपछि 12 घण्टाको लागि नमूना इन्क्युबेट गर्नुहोस्। 1% फर्मिक एसिड (FA) र 0.1% ट्राइफ्लुरोएसेटिक एसिड (TFA) (66) को अन्तिम सांद्रतामा पचाइएको पेप्टाइड घोललाई अम्लीकरण गर्नुहोस्, र त्यसपछि माथि वर्णन गरिए अनुसार 50 मिलीग्राम Sep-Pak C18 स्तम्भ (पानी) को साथ डिसल्ट गर्नुहोस् (25) । त्यसपछि पेप्टाइड 50% acetonitrile (ACN) को 1 मिलीलीटरमा निकालियो। ब्याचहरू (25) मा प्रोटिनको मात्रा प्रमाणित गर्न, सबै 40 CSF नमूनाहरूबाट 100 μl aliquots मिश्रित नमूना उत्पन्न गर्न जोडिएको थियो, जसलाई त्यसपछि पाँच विश्वव्यापी आन्तरिक मानक (GIS) (48) नमूनाहरूमा विभाजन गरिएको थियो। सबै व्यक्तिगत नमूनाहरू र संयुक्त मापदण्डहरू उच्च-गति भ्याकुम (Labconco) द्वारा सुकाइन्छ।
CSF नमूना प्रतिलिपि गर्दछ। Dayon र सहकर्मीहरूले पहिले CSF प्रतिलिपि 3 नमूनाहरू (45, 46) को प्रतिरक्षा कमी र पाचन वर्णन गरेका छन्। बाँकी प्रतिकृति नमूनाहरू व्यक्तिगत रूपमा इम्युनोडेप्लेट गरिएको थिएन। पहिले वर्णन गरिए अनुसार ट्रिप्सिनमा यी हटाइएका नमूनाहरू पचाउनुहोस् (१७)। प्रत्येक दोहोरिएको विश्लेषणको लागि, प्रत्येक नमूनाबाट एल्युटेड पेप्टाइडको 120 μl एलीकोटहरू सँगै जम्मा गरियो र TMT-लेबल गरिएको ग्लोबल आन्तरिक मानक (48) को रूपमा प्रयोग गर्न बराबर भोल्युम एलीकोट्समा विभाजित गरियो। सबै व्यक्तिगत नमूनाहरू र संयुक्त मापदण्डहरू उच्च-गति भ्याकुम (Labconco) द्वारा सुकाइन्छ। कम-प्रचुरता CSF प्रोटीनको संकेत बढाउनको लागि, प्रत्येक नमूनाबाट 125 μl संयोजन गरेर, प्रत्येक प्रतिकृति विश्लेषणको लागि एक "बढाइएको" नमूना तयार गरिएको थियो [अर्थात्, अनुसन्धान नमूनाको नक्कल गर्ने जैविक नमूना, तर उपलब्ध रकम छ। धेरै ठूलो (37, 69)] मिश्रित CSF नमूना (17) मा मर्ज गरियो। मिश्रित नमूनालाई 12 मिलीलीटर हाई सिलेक्ट टॉप१४ एबन्डेन्स प्रोटिन रिमुभल रेसिन (थर्मो फिशर साइन्टिफिक, A36372) को प्रयोग गरी इम्युनोरेमोभ गरिएको थियो, जसलाई माथि वर्णन गरिएको थियो, र पछिको धेरै TMT लेबलिङमा समावेश गरियो।